穩(wěn)定表達西尼羅病毒prM-E蛋白細胞系的構建.pdf

1、西尼羅病毒(West Nile Virus，WNV)屬黃病毒科，黃病毒屬，是一種重要的人獸共患傳染病病毒。多種鳥類和哺乳動物對該病毒易感，其中馬受WNV的危害最為嚴重。人感染該病毒后可導致西尼羅熱，嚴重者出現(xiàn)中樞神經系統(tǒng)疾病，甚至可致死亡。該病毒對養(yǎng)殖業(yè)和人類健康都構成了巨大威脅。WNV尚無特異性的治療方法，疫苗免疫接種是控制該病的主要措施。
　　目前國外已經報道了幾種獸用WNV疫苗，我國尚且沒有可用的WNV疫苗。傳統(tǒng)減毒活疫苗和

2、滅活疫苗免疫原性比較好，但仍存在缺陷，如滅活苗免產生疫應答較慢，只能誘導低水平體液免疫，弱毒疫苗具有有潛在性安全問題等，因此研究者們致力于研發(fā)更為安全有效的新型疫苗。
　　研究表明WNV prM-E蛋白能夠在哺乳動物細胞中表達，并自我組裝成病毒樣顆粒(VLPs)。該病毒樣顆粒與天然的病毒顆粒在誘導機體免疫應答方面有著相似的能力。本實驗室在之前的研究中已經利用哺乳動物表達系統(tǒng)成功表達了流行性乙型腦炎病毒(JEV)病毒樣顆粒。因此，本

3、實驗擬構建一個能夠持續(xù)穩(wěn)定表達WNV VLPs的真核細胞系，為后續(xù)制備WNV亞單位疫苗奠定基礎。
　　為鑒定細胞系表達目的蛋白情況，本實驗制備并篩選了一株WNV prM蛋白特異性單克隆抗體。該單抗細胞上清和腹水ELISA效價分別為1∶2048和1∶409600以上;單抗亞型鑒定結果表明10F7屬于IgG2a，其輕鏈類型為κ鏈;Western blot和IPMA結果顯示，該單抗與WNV prM特異性反應，與JEV無交叉反應。

4、　　將編碼WNV prM蛋白和E蛋白基因的重組質粒pCAG-opti-WNV-prME轉染進BHK-21細胞，然后用含有G418的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，經多次亞克隆并結合間接免疫熒光(IFA)和抗原捕獲ELISA方法篩選，最終得到一個能夠穩(wěn)定表達WNV prM-E蛋白的細胞系W-92。IFA和流式細胞術試驗結果表明該細胞系持續(xù)到第30代仍然保持高水平的蛋白表達。對W-92細胞系表達產物分離純化后電鏡觀察，結果表明prM蛋白可與E蛋白組裝成病

5、毒樣顆粒。將該病毒樣顆?？乖庖咝∈蠛?，可檢測到較高效價的ELISA抗體;誘導的抗體具有病毒中和作用，對WNV的中和抗體效價為1∶40，對JEV的中和效價介于1∶20～1∶80，有一定程度的交叉保護作用。將純化后的VLPs免疫鵝后，其血清的JEV中和效價介:1∶20～1∶40之間。在使用JEV病毒P3株對小鼠致死性病毒攻擊試驗中，免疫小鼠保護率為50％-70％。
　　本實驗構建了一株能持續(xù)穩(wěn)定表達WNV prM-E蛋白的真核細胞系