表達綠色熒光蛋白的限制性復(fù)制西尼羅病毒研究.pdf

1、西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)屬黃病毒科黃病毒屬，經(jīng)蚊媒傳播，多種鳥類和哺乳動物對該病毒易感，是一種重要的人獸共患傳染病病原，野生鳥類尤其是烏鴉為WNV的儲存宿主，人群對WNV普遍易感，人感染后可導(dǎo)致西尼羅熱，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、腦炎甚至死亡等。
　　目前針對WNV尚無特異性治療方法，亦無人用WNV疫苗。急需開展WNV防控相關(guān)研究，WNV研究中相關(guān)病毒操作需在較高級別生物安全實驗室進行，如生物安全3級實驗室

2、(BSL-3)，活病毒操作存在感染與泄露風(fēng)險，制約了WNV疫苗及藥物的研究。因此，本實驗擬建立表達綠色熒光蛋白(GFP)的限制性復(fù)制WNV，為WNV中和抗體檢測、抗病毒藥物篩選及感染機制研究建立技術(shù)平臺。
　　本研究參考WNVNY99株基因組序列，分段合成除結(jié)構(gòu)蛋白基因外的其它基因組序列，在缺失的結(jié)構(gòu)蛋白基因位置插入gfp報告基因序列，并按WNV基因組順序克隆于pCI-neo載體中，構(gòu)建含有GFP蛋白基因的重組WNV復(fù)制子質(zhì)粒pW

3、NVrepdCME-GFP。同時構(gòu)建表達WNV C蛋白的重組質(zhì)粒pCAG-WNV-C、穩(wěn)定表達WNV PrM/E蛋白的細胞系BWNV-ME及穩(wěn)定表達WNVC/PrM/E蛋白的細胞系BWNV-CME。當(dāng)復(fù)制子質(zhì)粒pWNVrepdCME-GFP和表達C蛋白的質(zhì)粒pCAG-WNV-C共轉(zhuǎn)染BWNV-ME細胞，或用復(fù)制子質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達C/PrM/E的細胞系BWNV-CME時，轉(zhuǎn)染細胞都能夠表達GFP，均可包裝得到高滴度WNV復(fù)制子顆粒(＞

4、106 PFU/mL)，包裝得到的WNV復(fù)制子顆粒命名為RRPs。將轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)液接種BHK-21細胞后，能感染細胞并且表達GFP。然而，感染BHK-21細胞的培養(yǎng)液不能再感染BHK-21細胞，說明RRPs只具有一次感染能力;而感染BWNV-CME細胞時，由于細胞系能穩(wěn)定表達WNV全部結(jié)構(gòu)蛋白，所以能夠不斷包裝出子代病毒，在BWNV-CME細胞中可類似于活病毒復(fù)制繁殖且造成細胞病變。如果在細胞培養(yǎng)液中加入羧甲基纖維素，釋放的RRPs只能

5、由最初感染的細胞向周邊擴展，一定時間后，便形成一個局限性病變細胞區(qū)，此即病毒噬斑。感染實驗表明RRPs對Vero、HEK-293、BHK-21和SK-N-SH四種不同類型細胞有不同嗜性，且對Vero易感性最高，與文獻報道WNV活病毒感染細胞特性一致，可用于WNV入侵細胞機制研究。根據(jù)RRPs在BWNV-CME細胞系中能夠復(fù)制并形成噬斑，我們建立了噬斑減少中和試驗(PRNT)，用于中和抗體檢測和抗病毒藥物篩選。用PRNT實驗對WNV VL

6、P亞單位疫苗免疫的鼠、鵝和馬血清進行了檢測，對小鼠血清測得中和抗體效價為1∶80～1∶160，與用WNV活病毒測定的結(jié)果相符合。ELISA測得的鵝和馬陽性血清用PRNT實驗測定時也呈陽性，抗體效價可達1∶160～1∶320。這些結(jié)果表明所包裝得到的的RRPs可以代替活病毒用于中和試驗，能夠用于疫苗免疫效果評價。RRPs感染BWNV-CME細胞過程中加入不同濃度抗WNV藥物Ribavirin和6-Azauridine，結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同濃度的