限制性與非限制性壓應(yīng)力對椎間盤髓核細(xì)胞表達(dá)蛋白多糖的影響.pdf

1、椎間盤退行性變(Intervertebral Disc Degeneration,DDD)是現(xiàn)代社會影響人類生活質(zhì)量的主要病癥之一。椎間盤主要由外部纖維環(huán)(Annulus Fibrosus,AF)及中央部髓核(Nucleus Pulposus,NP)組成,是連接相鄰兩個椎體的纖維軟骨盤,是一種粘彈性的固體材料,具有蠕變,松弛,滯后等特性。成人共有23個椎間盤,支撐人體上半身重量的同時吸收震蕩能量,并起到保護其中的中樞神經(jīng)的作用。

2、　　 髓核細(xì)胞在維持椎間盤正常生理功能中起重要作用。隨著個體發(fā)育(AgingProcess),髓核細(xì)胞的組成在不同階段經(jīng)歷復(fù)雜的變化;其中的脊索細(xì)胞逐漸消失,軟骨狀細(xì)胞逐漸增加。研究表明這種細(xì)胞組成的轉(zhuǎn)變,在椎間盤退行性變過程中有重要影響。由脊索細(xì)胞分泌的蛋白多糖與膠原組成的網(wǎng)絡(luò)可以形成腫脹壓以抵抗壓縮應(yīng)力。生理狀態(tài)下線性的多聚糖鏈富含硫酸鹽與糖醛酸離子而呈負(fù)電性;當(dāng)髓核受到外力擠壓時,水分大量滲出,離子濃度升高,引起滲透壓升高,不可

3、壓縮的蛋白多糖與膠原構(gòu)成的固體線性網(wǎng)絡(luò)發(fā)生應(yīng)變以抵抗壓縮應(yīng)力;當(dāng)外力消失時,高滲透壓將髓核組織周圍的水分重新吸收回來。
　　 椎間盤退行性變過程中,伴隨髓核中蛋白多糖、水分和Ⅱ型膠原減少;以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原、組織纖維化和硬度增加等現(xiàn)象。維持髓核細(xì)胞中蛋白多糖、膠原及水含量的穩(wěn)定對椎間盤的功能穩(wěn)定和發(fā)揮具有重要作用。大量研究表明力學(xué)環(huán)境對髓核細(xì)胞有重要影響,并且是引起椎間盤退行性變的一個重要因素之一。力學(xué)刺激對髓核細(xì)胞的影響包括其

4、細(xì)胞組成、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、含水量等。脊椎的主要功能是為軀干提供力學(xué)支撐,并且為軀干的各種運動提供條件。日常生活中,由于人體不同的姿勢,致使椎間盤受到力學(xué)刺激方式較復(fù)雜,通常是壓縮、彎曲和扭轉(zhuǎn)的組合,但其中壓縮應(yīng)力是最主要的。髓核在承受壓縮應(yīng)力時,髓核部位產(chǎn)生靜水壓,通過靜水壓將壓縮應(yīng)力均勻地傳遞到周圍的纖維環(huán),避免椎間盤的某一部位因過度承載而發(fā)生損傷,具有平衡壓縮應(yīng)力的作用。髓核組織產(chǎn)生靜水壓對纖維環(huán)的張力,根據(jù)力的相互原理,纖維環(huán)同

5、時對髓核組織產(chǎn)生一定的擠壓應(yīng)力。所以髓核在體內(nèi)受壓應(yīng)力時不僅受到軸向的壓力,縱向上還同時受到一定程度上纖維環(huán)的擠壓,即一定程度限制性壓應(yīng)力加載。由于纖維環(huán)的彈性、滲透性等特征及纖維環(huán)組織本身在不同個體、不同健康狀態(tài)之間有不同的幾何結(jié)構(gòu),使這種限制性應(yīng)力加載比較復(fù)雜,稱不上是嚴(yán)格意義的限制性加載,而是伴有一定程度的非限制性壓應(yīng)力加載。迄今為止,關(guān)于這兩種力學(xué)模型對髓核細(xì)胞表達(dá)及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響尚未見報道。為了研究這兩種力學(xué)模型(限制性

6、與非限制性)對髓核細(xì)胞的影響,本文研究中我們用大鼠的髓核細(xì)胞對其施加周期性應(yīng)力和靜態(tài)應(yīng)變力學(xué)刺激,以研究這兩種力學(xué)模型對髓核細(xì)胞表達(dá)蛋白多糖的影響。我們的主要研究工作和結(jié)果如下:
　　 ①限制性和非限制性力學(xué)模型對髓核細(xì)胞表達(dá)蛋白多糖的影響從大鼠尾部原代培養(yǎng)獲取髓核細(xì)胞,并將其種入藻酸鹽凝膠中進行3D培養(yǎng),24小時候后,分別施加周期性10 kPa的機械壓應(yīng)力和20％的靜態(tài)應(yīng)變。收集細(xì)胞樣品后,經(jīng)Real time PCR檢測蛋白

7、多糖基因表達(dá)。實驗結(jié)果表明,與無應(yīng)力對照組相比,周期性動態(tài)應(yīng)力加載使Glypican、Biglycan、Fibromodulin基因表達(dá)都呈上調(diào)趨勢,Aggrecan、Laminin以及Fibronectin基因表達(dá)保持不變;而Lumican基因表達(dá)的上調(diào)只發(fā)生在非限制性力學(xué)模型中。而靜態(tài)應(yīng)變加載中,Lumican基因表達(dá)在非限制性模型中呈下降趨勢,相反在限制性模型中基因表達(dá)上調(diào);其他基因表達(dá)在20％的應(yīng)變下都得到增強。為了解釋這一現(xiàn)象

8、,我們猜測Lumican基因表達(dá)可能與細(xì)胞、細(xì)胞核形變存在一定關(guān)聯(lián)。為了證實這一假設(shè),將髓核細(xì)胞接種在藻酸鹽凝膠中進行3D培養(yǎng),經(jīng)熒光染料染色后分別通過限制性與非限制性模型對藻酸鹽凝膠施加20％應(yīng)變,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞、細(xì)胞核形變,并通過Image J軟件分析。結(jié)果表明無論是周期性應(yīng)力加載還是靜態(tài)應(yīng)變加載,非限制性模型中髓核細(xì)胞、細(xì)胞核都發(fā)生較大形變,這一結(jié)果無法解釋Lumican基因表達(dá)在周期性應(yīng)力與靜態(tài)應(yīng)變試驗中呈相反趨勢這一現(xiàn)象

9、,這與我們的預(yù)先假設(shè)不符;
　　 ②線性雙相模型對藻酸鹽凝膠內(nèi)壓強的計算為了進一步探求引起Lumican基因表達(dá)上調(diào)的可能因素,我們利用雙相線性數(shù)學(xué)模型對限制性加載模型中藻酸鹽凝膠內(nèi)部各位點的應(yīng)變和壓強分布進行分析。模型中,假設(shè)藻酸鹽凝膠主要由理想流體(主要是水)和不可壓縮的凝膠基質(zhì)兩部分組成。計算結(jié)果表明在限制性力學(xué)模型中,20％的應(yīng)變下,藻酸鹽凝膠內(nèi)部持續(xù)存在壓強差,即藻酸鹽凝膠內(nèi)部持續(xù)存在一定的剪切力。
　　 ③流

10、體剪切應(yīng)力上調(diào)Lumican基因、蛋白表達(dá)為了驗證流體剪切力是否可以引起Lumican表達(dá)上調(diào),將原代培養(yǎng)獲得的大鼠髓核細(xì)胞接種在涂有Matrigel的載玻片上,然后通過流動腔對其施加不同大小(0.4dyn/cm2、ldyn/cm2)的流體剪切力,收獲細(xì)胞RNA,經(jīng)Real time PCR和Western Blot實驗分別檢測Lumican基因和蛋白表達(dá)。實驗結(jié)果表明,ldyn/cm2的流體剪切力上調(diào)Lumican基因及蛋白表達(dá)。據(jù)我

11、們所了解,這是第一次報道流體剪切力能引起髓核細(xì)胞中Lumican表達(dá)變化。
　　 ④流體剪切應(yīng)力激活髓核細(xì)胞ERK磷酸化并引起細(xì)胞骨架重排為了進一步研究流體剪切力對髓核細(xì)胞的影響,我們結(jié)合相關(guān)文獻,發(fā)現(xiàn)流體剪切力可以激活髓核細(xì)胞中MAPK家族中ERK的磷酸化,通過進一步實驗發(fā)現(xiàn)這一過程和Actin蛋白骨架密切相關(guān),流體剪切應(yīng)力可以引起Cytokeratin8細(xì)胞骨架的重排。
　　 綜上所述,本文用藻酸鹽凝膠對髓核細(xì)胞3D

12、培養(yǎng),并且通過限制性和非限制性力學(xué)模型對其施加動態(tài)和靜態(tài)力學(xué)刺激,以檢測不同力學(xué)加載方式對髓核細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)不同力學(xué)加載方式引起蛋白多糖Lumcian基因表達(dá)呈不同趨勢。進一步通過雙相線性數(shù)學(xué)模型計算,發(fā)現(xiàn)在靜態(tài)應(yīng)變加載中,藻酸鹽凝膠在限制性加載過程中存在持續(xù)的流體剪切力,推測正是這種內(nèi)部流體剪切應(yīng)力參與了髓核細(xì)胞調(diào)節(jié)Lumican表達(dá)的變化。經(jīng)過進一步實驗證實了這一假設(shè)并且發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞在流體剪切力作用下通過激活ERK磷酸化和蛋白骨架