單純皰疹病毒1型綠色熒光蛋白真核表達系統(tǒng)的構(gòu)建及初步應(yīng)用.pdf

1、目的 構(gòu)建人單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus,HSV-1)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)真核表達系統(tǒng),用于HSV感染的快速診斷.方法 提取HSV-1 DNA,利用DNA Star軟件設(shè)計對應(yīng)于HSV-1SM44株ICP6啟動子的PCR引物,引入BamHI和HindⅢ酶切位點.PCR擴增目的基因片段,將回收純化的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體構(gòu)建亞克隆,切下目的基因

2、,連接至真核表達載體pEGFP-1構(gòu)建重組質(zhì)粒pICP6-EGFP,經(jīng)雙酶切和DNA測序鑒定后,以陽離子脂質(zhì)體法(Lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染Vero細胞.轉(zhuǎn)染48h后,加入G418(400μg/ml)篩選陽性細胞克隆,進行放大培養(yǎng)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株Vero-ICP6-EGFP細胞.以不同量的HSV-1感染Vero-ICP6-EGFP細胞,分別于感染后6h、8h、10h,以倒置熒光顯微鏡檢測GFP熒光;于感染后15h以流式細

3、胞術(shù)測定GFP熒光的量和強度;同時以人巨細胞病毒和柯薩奇病毒檢測Vero-ICP6-EGFP細胞誘導(dǎo)表達的特異性.結(jié)果 經(jīng)PCR擴增獲得441bp大小的目的基因片段,構(gòu)建的重組質(zhì)粒pICP6-EGFP經(jīng)雙酶切及DNA測序鑒定,表明重組正確.重組質(zhì)粒pICP6-EGFP轉(zhuǎn)染Vero細胞后,以G418篩選11天出現(xiàn)陽性細胞克隆,建立的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株Vero-ICP6-EGFP細胞經(jīng)HSV-1誘導(dǎo)感染,最早于6h即可在倒置熒光顯微鏡下檢測到G