單純皰疹病毒Ⅱ型潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄子基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建表達(dá)2.2kbLAT的真核表達(dá)載體pVAX-LAT，使其在SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，為后續(xù)在HSV-2低滴度情況下，模擬人體內(nèi)神經(jīng)節(jié)中LAT的大量表達(dá)，抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)，提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 從皰疹病毒Ⅱ型基因組里，PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)為3200 bp的LAT基因。由于HSV-2LAT基因GC含量高(達(dá)78％)，且二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此不易擴(kuò)增，也不易直接連接。因此研究選用LAT基因與pVAX載體共有的BamH Ⅰ酶

2、切位點(diǎn)，將LAT基因分為HindⅢ-BamH Ⅰ(1200bp)和BamH Ⅰ-Pst Ⅰ(2000bp)兩段，分段克隆，并設(shè)計(jì)兩對(duì)含相應(yīng)酶切位點(diǎn)的引物，以一次PCR擴(kuò)增的LAT基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增獲得LAT全長(zhǎng)基因的兩分段產(chǎn)物HindⅢ-BamH I和BamH Ⅰ-Pst Ⅰ，分別連接至pVAX載體中，構(gòu)建兩個(gè)表達(dá)載體pVAX-HindⅢ-BamH Ⅰ和pVAX-BamH Ⅰ-Pst Ⅰ。重組載體采用通用引物進(jìn)行序列測(cè)定分析，與Ge