TOPO原核表達(dá)載體定向克隆和表達(dá)Ⅱ型單純皰疹病毒gG基因的免疫優(yōu)勢表位片段抗原.pdf

1、為了進(jìn)一步提高檢測試劑的特異性,我們構(gòu)建了表達(dá)gG蛋白免疫優(yōu)勢表位的表達(dá)載體,通過基因工程的方法獲得大量的gG片段抗原,并通過單克隆抗體和多克隆抗體初步檢測了gG蛋白的免疫原性和免疫反應(yīng)性,希望為制備國產(chǎn)的基因工程診斷試劑以及將來的大規(guī)模流行病學(xué)研究提供前期研究資料.第一章、單純皰疹病毒Ⅱ型基因組的制備:我們首先復(fù)蘇凍存的Vero細(xì)胞,傳代培養(yǎng)獲得單層貼壁細(xì)胞.在24孔微孔板的單層細(xì)胞中接種HSV-2標(biāo)準(zhǔn)株333.待細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病

2、變后,收獲感染HSV的Vero細(xì)胞,并通過常規(guī)裂解法提取333基因組DNA.第二章、單純皰疹病毒Ⅱ型gG片段引物的設(shè)計(jì):盡管gG是兩型HSV區(qū)別最大的蛋白,但兩型gG仍有38%的同源性,存在產(chǎn)生血清交叉反應(yīng)的可能性.因此,許多學(xué)者通過Phage Display和Pepscan的方法證實(shí)gG的免疫優(yōu)勢表位位于gG蛋白的羧基端.我們通過Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了擴(kuò)增該片段的引物.第三章、單純皰疹病毒Ⅱ型gG片段基因的體外PC

3、R擴(kuò)增:PCR方法是目前最為常用的獲得基因工程外源DNA的方法之一.我們通過提取的333株DNA為模板,擴(kuò)增含有幾乎所有的gG免疫優(yōu)勢表位,長為616bp的DNA片段.長度與預(yù)測的PCR產(chǎn)物相符,但為了確保下游的克隆表達(dá)工作,對DNA的序列進(jìn)一步測序給予證實(shí).第四章、單純皰疹病毒Ⅱ型gG片段基因的TA克隆及鑒定:TA克隆是目前較為常用的DNA克隆方法.我們經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化,連接到T載體上,轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α,并通過藍(lán)白斑、PCR、內(nèi)

4、切酶酶切篩選出重組質(zhì)粒,最后經(jīng)測序分析證實(shí)引物的設(shè)計(jì)成功.第五章、單純皰疹病毒Ⅱ型gG片段基因的TOPO定向克隆:TOPO原核表達(dá)載體利用拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的特性而有別與傳統(tǒng)的基因工程,該方法可以簡便的實(shí)現(xiàn)定向克隆和目的基因的高效表達(dá).我們對純化的PCR產(chǎn)物,與TOPO載體連接后,轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌,實(shí)現(xiàn)目的基因的定向克隆.第六章、單純皰疹病毒Ⅱ型gG片段的誘導(dǎo)表達(dá)及免疫原性鑒定:Western Blot是一種常用的蛋白鑒定方法.我們通過