單純皰疹病毒Ⅱ型糖蛋白D表達(dá)載體的構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、單純皰疹病毒2型(herpessimplexvirustype2，HSV-2)糖蛋白D(glycoproteinD，gD)是HSV-2US6基因的轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)物，與病毒吸附、膜融合有關(guān)，介導(dǎo)病毒胞間擴(kuò)散，其抗體有中和作用。gD2是HSV糖蛋白中免疫原性較強(qiáng)的糖蛋白，具有在HSV-2和HSV-1之間具有較高同源性的特征，能在體內(nèi)引起高滴度的中和抗體。HSV-2gD是抗HSV感染中最重要的保護(hù)性抗原，它能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，保護(hù)動(dòng)物免

2、受HSV的攻擊，抑制隱性感染的發(fā)生。HSV-2gD的高效表達(dá)和純化為深入研究其生物學(xué)功能和免疫學(xué)特性有積極的意義，同時(shí)對(duì)于其亞單位疫苗和抗體的制備奠定基礎(chǔ)。 該項(xiàng)研究主要內(nèi)容包括HSV-2gD的擴(kuò)增獲得，畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建和在畢赤酵母中的表達(dá)的研究。 在研究中，分析GENEBANK中的不同HSV-2gD基因序列，PCR擴(kuò)增去除信號(hào)肽的HSV-2gD全長(zhǎng)序列；并且將序列TA克隆到pMD18T線形載體中，獲得重組pMD1

3、8T-gD2質(zhì)粒；質(zhì)粒經(jīng)過(guò)序列測(cè)定分析，與GENEBANK中的NC_001798的HSV-2gD堿基序列同源性為99.4％，蛋白序列同源性為97.3％。 設(shè)計(jì)五條引物，加入XhoⅠ和XbaⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，同時(shí)引入HSV-2gBCTL表位序列基因和終止密碼子；以pMD18T-gD2質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增得到四個(gè)含有不同的末端的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切后和PICZαA空載體連接后得到四個(gè)HSV-2gD畢赤酵母

4、表達(dá)載體；載體采用通用引物測(cè)序分析，載體的分泌肽序列和設(shè)計(jì)的5'末端正確地接合，載體中的HSV-2gD堿基序列與GENEBANK中的NC_001798的HSV-2gD堿基序列同源性為99.3％，變化的部分沒(méi)有影響到堿基中的基序(motif)，蛋白序列同源性為97.3％，變化的部分沒(méi)有在蛋白的主要的功能區(qū)中。 將四個(gè)載體經(jīng)SacⅠ線形化后，電轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)入到畢赤酵母GS115中，篩選轉(zhuǎn)化子后，采用PCR的方法鑒定四個(gè)質(zhì)粒中目的序列都已