酵母表達(dá)肽抗生素hPAB-β的純化及其抗單純皰疹病毒活性分析.pdf

1、肽抗生素(Peptide antibiotics)為生物體基因編碼的小肽,通常由12～60個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,分子量小于5kDa。它們?cè)趧?dòng)、植物中的廣泛分布,提示其在生物體的生長(zhǎng)及抗感染中發(fā)揮重要作用。雖然發(fā)現(xiàn)了一些陰離子型肽抗生素,但絕大多數(shù)肽抗生素為陽離子型。如動(dòng)物的防御素(Defensins)即為一組陽離子型肽抗生素,它首先從兔的中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),而后發(fā)現(xiàn)在不同動(dòng)物的巨噬細(xì)胞、小腸paneth細(xì)胞、上皮細(xì)胞中也有表達(dá),具有抗細(xì)菌、抗

2、病毒、抗真菌等多種功能。根據(jù)半胱氨酸的分布及形成二硫鍵的方式不同,哺乳動(dòng)物的防御素分為α-,β-和θ-三個(gè)亞家族。人的防御素分子中均含有6個(gè)半胱氨酸,可形成3對(duì)二硫鍵。迄今已發(fā)現(xiàn)17種人防御素,包括6個(gè)α-防御素(HNP1～4,HD5和HD6)和11個(gè)β-防御素(HBD1～6和HBD25～29)。它們?cè)谌梭w遭受感染后,機(jī)體的特異性免疫建立之前發(fā)揮重要作用。在臨床耐藥菌問題日益嚴(yán)重、病毒感染又缺乏特異性治療手段的今天,肽抗生素的發(fā)現(xiàn)及深入

3、研究無疑給臨床抗感染治療點(diǎn)燃了新的希望。
　　 肽抗生素hPAB-β為人hBD-2的一種突變體,在我們的前期工作中通過刪除hBD-2N-端三個(gè)氨基酸,在C-端添加了一個(gè)天冬酰胺獲得,具有hBD-2相似的抗菌活性。在前期工作中,我們利用銅綠假單胞菌噬菌體PaP3基因編碼的PaP3-30蛋白作為承載分子對(duì)hPAB-β進(jìn)行了融合表達(dá),融合蛋白的表達(dá)率達(dá)到細(xì)菌總蛋白的40％,但該融合蛋白的分子量(23.6kDa)是目標(biāo)肽hPAB-β(4

4、.3kDa)的5倍多,故實(shí)際的hPAB-β表達(dá)量不到7％,表達(dá)效率不高;后來采用串聯(lián)體的方法(即將hPAB-β基因頭尾相連,構(gòu)建不同拷貝數(shù)的表達(dá)載體),但由于一個(gè)hPAB-β中就含有6個(gè)半胱氨酸,串聯(lián)的分子越多,二硫鍵的形成越復(fù)雜,融合蛋白形成的包涵體溶解性越差,難以實(shí)現(xiàn)hPAB-β的高效制備;最后根據(jù)畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白產(chǎn)量高及可進(jìn)行分泌型表達(dá)的特點(diǎn),我們成功構(gòu)建并實(shí)現(xiàn)了肽抗生素hPAB-β在畢赤酵母中的分泌型表達(dá),目標(biāo)多肽的產(chǎn)量

5、達(dá)到241.2±39mg/L,本論文報(bào)道了酵母高密度發(fā)酵肽抗生素hPAB-β的純化,以及在獲得高純度hPAB-β后,以單純皰疹病毒為模型,探討了hPAB-β對(duì)皰疹病毒的殺滅作用,主要實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下:
　　 1.肽抗生素hPAB-β在畢赤酵母中的高密度表達(dá)
　　 利用畢赤酵母易于高密度發(fā)酵的特性,在3.7L發(fā)酵罐中對(duì)重組了肽抗生素hPAB-β表達(dá)盒的pPIC9K-hPAB-β/GS115酵母優(yōu)5工程菌進(jìn)行高密度發(fā)酵,在

6、菌體達(dá)到一定生長(zhǎng)量后,用甲醇誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá),并對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線、目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。從生長(zhǎng)曲線中可見,在種子接種后的16h內(nèi),酵母菌生長(zhǎng)迅速,加入補(bǔ)料后,酵母菌繼續(xù)生長(zhǎng),在生長(zhǎng)32h(菌體濕重達(dá)236.7±25.3g/L)時(shí)停止補(bǔ)料,菌體生長(zhǎng)速度下降,在甲醇誘導(dǎo)期間,菌體生長(zhǎng)緩慢。在誘導(dǎo)過程中,間隔8～12h取樣進(jìn)行TricineSDS-PAGE電泳分析,結(jié)果可見,在剛開始誘導(dǎo)時(shí),上清中未見目標(biāo)肽分泌,加入誘導(dǎo)劑12h后,隱

7、約見有表達(dá)條帶,爾后表達(dá)帶逐漸增強(qiáng),到誘導(dǎo)60h下罐時(shí)達(dá)到最高。用Brandford法測(cè)得3次發(fā)酵液的總蛋白濃度分別為664.0mg/L,781.8mg/L和721.3mg/L。用Bio-Rad公司Quantity One軟件條帶檢測(cè)灰度分析工具對(duì)凝膠電泳后的蛋白條帶進(jìn)行分析,目的蛋白約占發(fā)酵上清液總蛋白的33.4％,故可知發(fā)酵上清中目的蛋白的表達(dá)量約為241.2±29.5 mg/L,實(shí)現(xiàn)了重組畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)肽抗生素hPAB-β

8、的目標(biāo)。
　　 2.肽抗生素hPAB-β的純化與鑒定
　　 純化的目的不僅僅是要獲得高純度的目標(biāo)產(chǎn)物,還要使目標(biāo)產(chǎn)物的生物學(xué)活性在純化過程中不喪失,這就要根據(jù)目標(biāo)分子與雜質(zhì)的差異設(shè)計(jì)純化路線,經(jīng)過試驗(yàn)摸索加以優(yōu)化?？紤]到hPAB-β為一陽離子小肽(pI9.001),我們?cè)O(shè)計(jì)了10kDa膜過濾、反相層析、陽離子交換、分子篩脫鹽等純化技術(shù)對(duì)目標(biāo)肽進(jìn)行純化,最終從每升發(fā)酵液中純化得到74.9±1.5mg目標(biāo)蛋白,純度達(dá)到98％

9、以上,總體純化效率為31.5％,實(shí)現(xiàn)了酵母表達(dá)肽抗生素hPAB-β的分離純化。獲得純化的hPAB-β后,我們利用Westernblot對(duì)目標(biāo)肽進(jìn)行了鑒定,目標(biāo)產(chǎn)物能與hPAB-β的特異性抗體反應(yīng),表明純化出的蛋白即為需要的目標(biāo)物。進(jìn)一步利用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)了純化產(chǎn)物對(duì)革蘭陰、陽細(xì)菌的殺滅活性,結(jié)果表明純化產(chǎn)物具有生物學(xué)活性,為進(jìn)一步開展hPAB-β的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.單純皰疹病毒的分離培養(yǎng)與鑒定
　　 病毒分

10、離培養(yǎng)和分型是生殖器皰疹實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,通常需時(shí)2～4天,然而不同的標(biāo)本類型對(duì)培養(yǎng)結(jié)果干擾較大。隨著基因組學(xué)的進(jìn)展,單純皰疹病毒的基因組全序列均已清楚,為分子生物診斷技術(shù)(PCR、核酸探針等)在單純皰疹病毒感染診斷中的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。為研究肽抗生素hPAB-β的抗病毒活性,我們以單純皰疹病毒為模型,采集了60例臨床上疑似生殖器皰疹患者病變部位的標(biāo)本進(jìn)行病毒分離培養(yǎng),并根據(jù)單純皰疹病毒DNA多聚酶基因序列合成了型特異性PCR引

11、物,對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測(cè),并與細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了對(duì)比分析。結(jié)果60份疑為生殖器皰疹患者的標(biāo)本經(jīng)HSV型特異性PCR檢測(cè),有45份可見約390bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(HSV-2),陽性率75％,而HSV-1特異性引物檢測(cè)為陰性;利用Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng),結(jié)果陽性36例,陽性率60％,和PCR檢測(cè)相比,差異非常顯著(X2=24.38,P＜0.01)。從患者皮損的類型來看,水皰和膿皰標(biāo)本的病毒培養(yǎng)和PCR檢測(cè)陽性率均較高(80～93.3

12、％),糜爛、結(jié)痂、斑丘疹標(biāo)本檢測(cè)陽性率較低,尤以斑丘疹最低,提示對(duì)疑為生殖器皰疹病人作病原學(xué)診斷,采集水皰、膿皰標(biāo)本進(jìn)行病毒分離或。PCR檢測(cè)較佳。
　　 4.肽抗生素hPAB-β抗HSV-2活性分析
　　 利用重組畢赤酵母工程菌pPIC9k-hPAB-β/GS115進(jìn)行高密度發(fā)酵、純化,制備肽抗生素hPAB-β。采用稀釋法檢測(cè)了重組hPAB-β對(duì)Vero細(xì)胞的毒性,結(jié)果顯示高濃度的肽抗生素hPAB-β(1mmol/L以

13、上)對(duì)細(xì)胞有毒性,其對(duì)Vero細(xì)胞的最大無毒濃度為400μmol/L,約1.72mg/ml。以臨床標(biāo)本中分離的HSV-2為研究對(duì)象,將肽抗生素hPAB-β作用于HSV-21.5h后接種細(xì)胞,結(jié)果可見各實(shí)驗(yàn)稀釋度(400～10μmol/L)的肽抗生素都有抑制病毒噬斑形成的能力,隨著肽抗生素濃度的升高,噬斑形成數(shù)減少,表明經(jīng)酵母高密度發(fā)酵的肽抗生素hPAB-β對(duì)臨床分離的HSV-2有直接殺滅作用。病毒液對(duì)照(100TCID50的病毒液0.2

14、ml+PBS0.2m1)在培養(yǎng)20h時(shí)即開始出現(xiàn)細(xì)胞病變,培養(yǎng)2d后,對(duì)培養(yǎng)孔用1％結(jié)晶紫(含10％甲醛)染色,記數(shù)平均噬斑形成數(shù)目為101.7±5.5個(gè)。在同等實(shí)驗(yàn)條件下,阿昔洛韋的高濃度孔才能見其病毒抑制效應(yīng),在濃度降低至100μmol/L以下時(shí),病毒噬斑形成數(shù)沒有明顯改變?；诖?選用濃度為200μmol/L,肽抗生素hPAB-β和阿昔洛韋的抗病毒活性進(jìn)行對(duì)比分析,以病毒對(duì)照組的噬斑形成率為100％,則肽抗生素hPAB-β作用組的

15、噬斑形成率為48.7％;200μmol/L阿昔洛韋作用組的噬斑形成率為39.0％;與病毒對(duì)照組相比,兩個(gè)藥物作用組的病毒噬斑形成都有顯著降低(P值分別為0.02545和0.0103),肽抗生素作用組與阿昔洛韋藥物對(duì)照組相比,噬斑形成率略高(前者48.7％,后者39.0％),但兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.06927)。表明肽抗生素hPAB-β對(duì)HSV-12具有良好的殺滅活性。
　　 綜上所述,利用重組畢赤酵母高密度發(fā)酵,肽抗生素hP

16、AB-β的表達(dá)量達(dá)到241.2±29.5mg/L,經(jīng)10kDa膜過濾、反相層析、離子交換、分子篩層析等處理,從酵母發(fā)酵上清中純化得高純度目標(biāo)產(chǎn)物74.9±1.5mg/L,總體純化效率為31.5％,該純化產(chǎn)物具有殺滅革蘭陰、陽性細(xì)菌的能力。采用PCR、病毒分離培養(yǎng)對(duì)60例疑似生殖器皰疹患者的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)與鑒定研究,有45份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物陽性,陽性率75％,均為HSV-2,而HSV-1型特異性引物的檢測(cè)為陰性;用Vero細(xì)胞進(jìn)行的病毒分離培

17、養(yǎng),結(jié)果36例陽性,陽性率60％,和PCR檢測(cè)相比,差異非常顯著。利用病毒噬斑計(jì)數(shù)法對(duì)肽抗生素hPAB-β的抗病毒活性進(jìn)了分析,結(jié)果在200μmol/L hPAB-β或阿昔洛韋時(shí)的作用下,前者的病毒噬斑形成率為48.7％,后者為39.0％,與病毒對(duì)照組相比,兩者均顯著下降,而肽抗生素hPAB-β與阿昔洛韋組相比,對(duì)病毒噬斑形成的抑制無顯著差異(P=0.06927),表明經(jīng)酵母表達(dá)純化的肽抗生素hPAB-β具有抗HSV-2的活性,為深入分