肽抗生素hPAB-β制備工藝優(yōu)化及生物學(xué)活性初探.pdf

1、肽抗生素(peptideantibiotics)是近年來發(fā)現(xiàn)的生物體基因編碼的具有抗微生物活性的小肽，通常是由12～60個(gè)氨基酸所組成，分子量＜10kDa，是生物體天然免疫的重要組成部分。它作為一種新型的抗感染制劑，具有廣譜、高效的殺菌活性，在傳統(tǒng)抗生素耐藥性問題日益嚴(yán)重的今天，已成為抗生素研發(fā)中的一個(gè)重要熱點(diǎn)之一。 在過去五年，圍繞肽抗生素hPAB-β的研發(fā)工作中，我們已經(jīng)基本形成了一條完整的生產(chǎn)工藝路線。肽抗生素hPAB-β

2、是用簡(jiǎn)并引物從人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中克隆到的一人β型肽抗生素。在獲得其堿基和氨基酸編碼序列后，通過化學(xué)合成并復(fù)性，證實(shí)了其抗菌活性。然后根據(jù)其特性，我們?cè)O(shè)計(jì)并篩選到了一個(gè)承載分子PaP3.30(16.7kDa)，利用該分子能使hPAB-β融合蛋白在大腸埃希菌中的表達(dá)量達(dá)到菌體總蛋白的40％。然而，由于目標(biāo)蛋白hPAB-β(4.3kDa)在整個(gè)融合蛋白分子(23.6kDa)中只占約1/6，其實(shí)際表達(dá)量占菌體總蛋白的比率(表達(dá)率)僅約7％，產(chǎn)

3、量依然低下。為此，我們改用同尾酶法設(shè)計(jì)并構(gòu)建了hPAB-β多拷貝串聯(lián)體，并從得到的串聯(lián)體基因工程菌中篩選出3拷貝最佳工程菌phPAB-β(3)/JM109，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，確定了肽抗生素hPAB-β制備的工藝路線：工程菌發(fā)酵→高壓勻漿破壁→包涵體提取→包涵體溶解→親和層析純化→羥胺裂解→反相層析純化→復(fù)性→分子篩層析純化→活性產(chǎn)物，最終得到了具有抗菌活性的目標(biāo)肽抗生素hPAB-β。 在上述制備工

4、藝路線中，仍然存在一些問題，需要進(jìn)一步優(yōu)化和完善：①發(fā)酵工程菌phPAB-β(3)/JM109發(fā)酵后的細(xì)菌濕重最高只有39.2g/L，與理想的高密度發(fā)酵有一定差距。②在羥胺裂解反應(yīng)中，存在著不同批次裂解產(chǎn)物的產(chǎn)量不穩(wěn)定現(xiàn)象，需要優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白產(chǎn)量最大化。此外，所制備的目的肽抗生素的抗菌活性如何?抗菌譜廣否?有沒有細(xì)胞毒作用?等等，也是我們所關(guān)心的。為此，我們開展了本課題的研究，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1.hPAB-β3拷

5、貝串聯(lián)體基因工程菌的重新構(gòu)建：通過將重組質(zhì)粒pQE31-hPAB-β(3)轉(zhuǎn)化入攜帶有pREP4質(zhì)粒的感受態(tài)大腸埃希菌M15中，獲得了工程菌phPAB-β(3)/M15。工程菌的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，在AMP和KAN雙重選擇壓力下，新建工程菌的重組質(zhì)粒保存率仍為100％。進(jìn)一步通過14％SDS-PAGE蛋白電泳，篩選出目標(biāo)融合蛋白的高表達(dá)菌株，將之與以前的發(fā)酵工程菌phPAB-β(3)/JM109進(jìn)行了發(fā)酵對(duì)比研究。在1升搖瓶、3.7升和

6、10升發(fā)酵罐中的發(fā)酵結(jié)果顯示phPAB-β(3)/JM109發(fā)酵產(chǎn)量(g/L)分別為7.483+0.562，14.879±0.533，36.886±2.098，目標(biāo)蛋白表達(dá)率(％)分別為30.64±4.79，29.02±2.35，29.4±1.71；而phPAB-β(3)/M15的發(fā)酵產(chǎn)量(g/L)分別為9.265±0.241，24.25±1.466，53.213±2.577，目標(biāo)蛋白表達(dá)率(％)分別為32.3±2.51，29.58±4

7、.29，30.2±1.07。其中，在3種發(fā)酵規(guī)模下的細(xì)菌濕重，分別經(jīng)過t檢驗(yàn)，表明兩者間有非常顯著的差異(P＜0.01)，而目標(biāo)蛋白表達(dá)率經(jīng)過t檢驗(yàn)，表明兩者無顯著性差異。由此可見，新構(gòu)建的工程菌phPAB-β(3)/M15在3種發(fā)酵放大的規(guī)模中，發(fā)酵的濕菌產(chǎn)量都明顯優(yōu)于原工程菌phPAB-β(3)/JM109。隨后又通過15％Tricine-SDS-PAGE蛋白電泳，對(duì)phPAB-β(3)/M15目標(biāo)蛋白的表達(dá)形式和親和層析的效果進(jìn)行

8、鑒定，提示：新構(gòu)建工程菌中目的蛋白仍然采用包涵體形式表達(dá)，且親和層析分離效果良好。因此，在生物工程技術(shù)的上游，通過構(gòu)建新的工程菌phPAB-β(3)/M15，在相似的目標(biāo)蛋白表達(dá)率情況下，發(fā)酵的濕菌量顯著增加，降低了目的分子制備的成本。表明它是更理想的，適合于發(fā)酵生產(chǎn)的基因工程菌。 2.hPAB-β3拷貝融合蛋白羥胺裂解反應(yīng)條件的優(yōu)化：首先，通過BCA法對(duì)親和層析分離的3拷貝融合蛋白進(jìn)行蛋白定量(15mg/m1)。然后，用8M尿

9、素將該融合蛋白稀釋五倍后，在45℃，pH9.0，2M鹽酸羥胺的裂解條件下，分別裂解反應(yīng)2、4.5、8小時(shí)；另外，采用8M尿素將該融合蛋白分別稀釋2、5、8、10、20倍后，在45℃，pH9.0，2M鹽酸羥胺的裂解條件下，裂解反應(yīng)4.5小時(shí)。最后以反相層析的蛋白分離效果，作為3拷貝融合蛋白羥胺裂解效果的判定依據(jù)，得出羥胺裂解反應(yīng)中被裂解的hPAB-β3拷貝融合蛋白最佳的濃度為1.875mg/L，最佳反應(yīng)時(shí)間為4.5hr。這樣，在生物工程技

10、術(shù)的下游，對(duì)融合蛋白羥胺裂解反應(yīng)的條件，進(jìn)行了完善和優(yōu)化。 3.肽抗生素hPAB-β體外抗菌活性的測(cè)定：首先，采用瓊脂擴(kuò)散法粗測(cè)了新制備的肽抗生素hPAB-β的抗菌活性，證實(shí)了它除具有抗細(xì)菌作用外，還有抗真菌活性。其次，測(cè)定了肽抗生素hPAB-β對(duì)129個(gè)來自不同種類的臨床分離株的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，并以氨芐青霉素(AMP)作對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示肽抗生素hPAB-β對(duì)這129個(gè)臨床分離株的MIC為31.

11、25～250μg/ml，MBC為125～250μg/ml，而AMP對(duì)這些菌株的MIC基本＞1mg/ml，呈耐藥性表現(xiàn)，證實(shí)了肽抗生素hPAB-β廣譜而高效的抗菌活性。最后，又以金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC25923)作為肽抗生素hPAB-β測(cè)試對(duì)象，并以臨床常用于治療革蘭陽性菌感染的克林霉素、新青Ⅱ和去甲萬古霉素作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，描繪了相應(yīng)的生長(zhǎng)抑制曲線，表明hPAB-β的抗菌活性呈劑量依賴性，且抗菌效力低于去甲萬古霉素，而強(qiáng)于新青

12、Ⅱ，克林霉素；在時(shí)效上，抑菌時(shí)間略短于新青Ⅱ、克林霉素，而長(zhǎng)于去甲萬古霉素。 4.肽抗生素hPAB-β對(duì)真核細(xì)胞的細(xì)胞毒作用：首先，分別采用0.25、0.5、1、2、5mg/ml濃度的肽抗生素hPAB-β對(duì)健康人及小鼠的2％紅細(xì)胞懸液進(jìn)行作用，并設(shè)空白對(duì)照，觀察肽抗生素hPAB-β對(duì)紅細(xì)胞的溶血活性。結(jié)果表明：在生理鹽水中，肽抗生素hPAB-β(≤5mg/ml)對(duì)小鼠及人的紅細(xì)胞均無溶血活性。其次，將10mg/ml肽抗生素hPA

13、B-β采用連續(xù)倍比稀釋至31.25μg/ml，利用倒置顯微鏡觀察了各濃度肽抗生素hPAB-β，作用于正常猴腎VERO細(xì)胞48小時(shí)前后的形態(tài)改變，并設(shè)磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)照。結(jié)果顯示：肽抗生素hPAB-β(≥625μg/m1)作用后的細(xì)胞，生長(zhǎng)狀況不良，甚至與死亡的細(xì)胞在相差顯微鏡下表現(xiàn)相同，提示肽抗生素hPAB-β對(duì)VERO細(xì)胞有細(xì)胞毒作用。最后，通過MTT細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了肽抗生素hPAB-β對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、猴腎VERO

14、細(xì)胞、人血管內(nèi)皮ECV304細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為288.636、319.595、280.681μg/ml。經(jīng)t檢驗(yàn)，表明三者無顯著性差異，且根據(jù)抗腫瘤藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)(當(dāng)IC50＞30μg/ml時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯抑制作用)，可以認(rèn)為肽抗生素hPAB-β對(duì)正常細(xì)胞VERO、ECV304和肝癌細(xì)胞HepG2都具有一定的非選擇性的細(xì)胞毒作用，但是對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2不具有抗腫瘤活性。 綜上所述，本研究成功構(gòu)建了新的

15、基因工程菌phPAB-β(3)/M15，發(fā)酵濕菌產(chǎn)量平均達(dá)到了53.213g/L，確定了3拷貝融合蛋白羥胺裂解的最佳濃度1.875mg/ml和最佳裂解時(shí)間4.5小時(shí)，實(shí)現(xiàn)了肽抗生素hPAB-β制備工藝的進(jìn)一步優(yōu)化。同時(shí)，肽抗生素hPAB-β對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和129個(gè)臨床分離菌株的MIC和MBC測(cè)定結(jié)果，顯示出了其與傳統(tǒng)抗生素相比，廣譜而高效的抗菌活性。另外，通過肽抗生素hPAB-β對(duì)人和小鼠紅細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞HepG2、猴腎VERO細(xì)胞以及人