抗生素生物效價測定

1、實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一抗生素生物效價測定抗生素生物效價測定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.掌握抗生素生物效價測定的原理和方法；2.掌握管碟法測定抗生素生物效價相關(guān)的操作方法。【實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理】抗生素的效價常采用微生物學(xué)方法測定，它是利用抗生素對特定的微生物具有抗菌活性的原理來測定抗生素效價的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效價測定的國際通用方法，我國藥典也采用此法。管碟法是根據(jù)抗生素在瓊脂平板培養(yǎng)基中的擴(kuò)散滲透作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品和檢品兩者對試驗(yàn)菌的抑菌

2、圈大小來測定供試品的效價。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性試驗(yàn)菌的瓊脂平板上放置小鋼管（內(nèi)徑6.00.lmm，外徑8.00.lmm，高100.lmm），管內(nèi)放人標(biāo)準(zhǔn)品和檢品的溶液，經(jīng)16~18小時恒溫培養(yǎng)，當(dāng)抗生素在菌層培養(yǎng)基中擴(kuò)散時，會形成抗生素濃度由高到低的自然梯度，即擴(kuò)散中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當(dāng)抗生素濃度達(dá)到或高于MIC（最低抑制濃度）時，試驗(yàn)菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透明的無菌生長的區(qū)域，常呈圓形，稱為抑菌圈。根據(jù)

3、擴(kuò)散定律的推導(dǎo)，抗生素總量的對數(shù)值與抑菌圈直徑的平方成線性關(guān)系，比較抗生素標(biāo)準(zhǔn)品與檢品的抑菌圈大小，可計(jì)算出抗生素的效價。常用的管碟法有：一劑量法、二劑量法、三劑量法。后二法已經(jīng)列入藥典。二劑量法系將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品各稀釋成一定濃度比例（2:1或4:1）的兩種溶液，在同一平板上比較其抗藥活性，再根據(jù)抗生素濃度對數(shù)和抑菌圈直徑成直線關(guān)系的原理來計(jì)算供試品效價。取含菌層的雙層平板培養(yǎng)基，每個平板表面放置4個小鋼管，管內(nèi)分別放入供試品高、

4、低劑量和標(biāo)準(zhǔn)品高、低劑量溶液。先測量出四點(diǎn)的抑菌圈直徑，按下列公式計(jì)算出檢品的效價。（1）求出W和V：W=（SHUH）（SLUL）(式2.101)V=（UHUL）（SHSL）(式2.102)式中：UH：供試品高劑量之抑菌圈直徑；UL：供試品低劑量之抑菌圈直徑；SH：標(biāo)準(zhǔn)品高劑量之抑菌圈直徑；SL：標(biāo)準(zhǔn)品低劑量之抑菌圈直徑；（2）求出θ：θ=Dantilog（IVW）(式2.103)2.稀釋從冰箱中取出的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，必須先在室溫放置，使其

5、溫度達(dá)到室溫后，方可量取。標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液的稀釋應(yīng)采用容量瓶，每步稀釋，取樣量不得少于2mL，稀釋步驟一般不超過3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管2~3次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度開始放溶液。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與供試品用的緩沖液應(yīng)同一批和同瓶，（預(yù)計(jì)不夠時，應(yīng)事先與另一瓶混勻后再用），以免因pH或濃度不同影響預(yù)定結(jié)果。稀釋時，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體

6、完全流下，再準(zhǔn)確補(bǔ)加至刻度。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品高低濃度之比為2:1或4:1，但所選用的濃度必須在劑量反應(yīng)直線范圍內(nèi)。3.雙碟制備在超凈工作臺上，用滅菌大口吸管（20mL），吸取已融化的培養(yǎng)基20mL注入雙碟內(nèi)，作為培養(yǎng)基的底層，等凝固后更換干燥的陶瓦蓋覆蓋，放置20~30min，備用。取出試驗(yàn)用菌懸液，按已試驗(yàn)適當(dāng)?shù)木浚ǜ邼舛人碌囊志χ睆?8~22mm），用滅菌吸管吸取菌懸液加入已融化并保溫在水浴中（一般細(xì)菌48~50℃，芽孢可至60

7、℃）的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻作為菌層用。用滅菌大口5mL吸管，吸取菌層培養(yǎng)基5mL，使均勻攤布在底層培養(yǎng)基上，置水平臺上待凝固，用陶瓦蓋覆蓋，放置20~30min，備用。4.放置鋼管用鋼管放置器，或其他方法將鋼管一致、平穩(wěn)地放入培養(yǎng)基上，鋼管放妥后，應(yīng)使雙碟靜置5~10min，使鋼管在瓊脂內(nèi)稍下沉穩(wěn)定后，再開始滴加抗生素溶液。5.滴加抗生素溶液每批供試品取5~10個雙碟，滴加溶液用毛細(xì)滴管或定量加樣器，在滴加之前須用滴加液洗2~3次。在雙碟的4

8、個鋼管中以對角線滴加標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的高、低二種濃度的溶液，滴加順序?yàn)镾H→TH→SL→TL，也可用SL→TL→TH→SH。（S代表標(biāo)準(zhǔn)品，T代表供試品，H代表高濃度，L代表低濃度），滴加溶液至鋼管口平滿，注意滴加溶液間隔不可過長，因溶液的擴(kuò)散時間不同影響測定結(jié)果。滴加完畢，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，平穩(wěn)置于雙碟托盤內(nèi)，雙碟疊放不可超過3個，避免受熱不均，影響抑菌圈大小，以水平位置平穩(wěn)移入35~37℃恒溫培養(yǎng)室，培養(yǎng)至所需時間。6.抑菌圈測量