PRRSV N基因原核雙基因表達(dá)載體與畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)研究.pdf

1、本研究以RT-PCR分別擴增了PRRSV美洲型N基因(以NA表示)和歐洲型N基因(以NE表示)，并開展了以下兩方面的研究：(1)將NA和NE基因片段同時插入pET-32a(+)中構(gòu)建了雙基因融合表達(dá)載體pET-32a(+)-NA-NE，并進(jìn)行了表達(dá)研究：(2)將NA和NE基因片段分別插入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中構(gòu)建了pPIC9K-NA和pPIC9K-NE，并進(jìn)行了表達(dá)研究。本研究為深入研究N蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、制備診斷試劑及開展分型

2、診斷等奠定了基礎(chǔ)，對PRRS的防控具有重要的意義。 1.雙基因融合表達(dá)載體pET-32a(+)-NA-NE的構(gòu)建及其表達(dá)研究 針對美洲型和歐洲型PRRSVN基因設(shè)計兩對特異性引物，以RT-PCR擴增獲得NA和NE基因，分別插入pMD19-Tsimple載體中，構(gòu)建了pMD19-T-NA和pMD19-T-NE，并對兩重組質(zhì)粒進(jìn)行了測序鑒定。將pMD19-T-NA和pET-32a(+)經(jīng)NcoI&EcoRI雙酶切后連接構(gòu)建了

3、pET-32a(+)-NA重組質(zhì)粒；再將pET-32a(+)-NA和pMD19-T-NE經(jīng)EcoRI&NotI雙酶切后連接構(gòu)建了雙基因融合表達(dá)載體pET-32a(+)-NA-NE。pET-32a(+)-NA-NE經(jīng)PCR和不同雙酶切鑒定均得到預(yù)期大小的片段，結(jié)果表明成功構(gòu)建了雙基因融合表達(dá)載體pET-32a(+)-NA-NE。將pET-32a(+)-NA-NE轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21進(jìn)行了表達(dá)，IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為1.0mM/L，最佳誘導(dǎo)

4、時間為3h；經(jīng)SDS-PAGE分析表達(dá)的融合N蛋白(NA-NE蛋白)大小約為49kD；經(jīng)Westernblotting表明，該融合N蛋白具有良好的反應(yīng)原性。 2.畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-NA和pPIC9K-NE的構(gòu)建及其表達(dá)研究 針對NA基因重新設(shè)計一對引物(只更換酶切位點)擴增獲得了NA基因，插入pMDl9-Tsimple載體中構(gòu)建了pMD19-T-NA1。將pMD19-T-NA1和pMD19-T-NE經(jīng)EcoR

5、I&NotI雙酶切后回收NA和NE基因片段，分別插入經(jīng)EcoRI&NotI雙酶切處理的pPIC9K中構(gòu)建了畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-NA和pPIC9K-NE，并分別對兩種重組質(zhì)粒進(jìn)行了PCR和雙酶切鑒定。pPIC9K-NA和pPIC9K-NE經(jīng)PCR鑒定和不同雙酶切鑒定均得到預(yù)期大小的片段，結(jié)果表明成功構(gòu)建pPIC9K-NA和pPIC9K-NE。將pPIC9K-NA和pPIC9K-NE經(jīng)SacI線性化后分別電轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GS1