人巨細(xì)胞病毒pp65基因片段的原核表達(dá)、鑒定以及酵母表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、目的:選擇HCMVpp65基因中能激發(fā)CTL和B細(xì)胞免疫的優(yōu)勢抗原表位基因pp65(1087-1515nt)基因片段，PCR擴(kuò)增片段，構(gòu)建表達(dá)載體并在原核細(xì)胞中進(jìn)行功能性表達(dá)，進(jìn)一步鑒定表達(dá)蛋白的抗原性；構(gòu)建酵母pPIC9K-pp65真核表達(dá)載體。 方法:參考pET-21a(+)載體序列多克隆位點(diǎn)，根據(jù)pp65(1087-1515nt)基因序列設(shè)計(jì)引物，堿性質(zhì)粒抽提法提取含有HCMVpp65全長基因的pGEM-T-pp65質(zhì)粒，

2、通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得目的pp65(1087-1515nt)基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切、T4連接酶連接、藍(lán)白斑篩選構(gòu)建pET-21a(+)-pp65質(zhì)粒；經(jīng)酶切鑒定及核酸序列測定后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳并經(jīng)western blot鑒定pp65融合蛋白的抗原性；包涵體蛋白經(jīng)過復(fù)性純化包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板，ELISA法檢測pp65融合蛋白的抗原性。參考p

3、PIC9K載體序列多克隆位點(diǎn)，根據(jù)pp65(1087-1515nt)基因序列設(shè)計(jì)引物，以pGEM-T-pp65質(zhì)粒為摸板，PCR獲得目的pp65(1087 -1515nt)基因。PCR產(chǎn)物與pMD19--T simple載體連接，藍(lán)白斑篩選構(gòu)建的pMD19--T simple-pp65質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序鑒定后，以SnaB Ⅰ和BlnⅠ酶切pMD19-simple-pp65質(zhì)粒和pPIC9K載體，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細(xì)胞