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文檔簡介
1、 分類號： 分類號：R373 R373 密級：一般 密級：一般 U D C：616 616-002 002 編號： 編號：2010212590 20
2、10212590 廣 州 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 人巨細(xì)胞病毒 人巨細(xì)胞病毒 UL148 基因的 基因的蛋白質(zhì)表達(dá) 蛋白質(zhì)表達(dá) 研 究 生 研 究 生 ：謝斌華 謝斌華 導(dǎo) 師： 師： 王 波 教授 教授 申請學(xué)位級別： 申請學(xué)位級別：醫(yī)學(xué)碩士 醫(yī)學(xué)碩士 年 級： 級：二〇一〇級 學(xué) 科 專 業(yè) : : 兒 科 學(xué) 研 究 方 向： 向：HCMV 分子遺傳學(xué) 分子遺傳學(xué) 論文提
3、交日期： 論文提交日期：二〇一三 一三年五月 年五月 論文答辯日期： 論文答辯日期：二〇一三 一三年五月 年五月 學(xué) 位 類 型： 型：醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)位 醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)位 學(xué)位授予單位： 學(xué)位授予單位：廣州醫(yī)科大學(xué) 廣州醫(yī)科大學(xué) 答辯委員會(huì)主席： 答辯委員會(huì)主席： 評 閱 人： 人： 二〇一三 一三年五月 年五月目錄 目錄 摘要 ..............................................
4、............................................................................................................... 1 ABSTRACT ................................................................................................
5、................................................ 3 縮略詞表 ..................................................................................................................................................... 5 第一章 前言 ...
6、............................................................................................................................................ 6 1.人巨細(xì)胞病毒(HCMV)背景簡介 ..........................................................
7、......................................... 6 2.人巨細(xì)胞病毒(HCMV)臨床低傳代病毒株 UL148 基因研究現(xiàn)狀 .............................................. 7 3.蛋白質(zhì)表達(dá) ................................................................................
8、...................................................... 8 4.IPTG 誘導(dǎo)表達(dá) .............................................................................................................................. 10 5.pET32a 表達(dá)載體 ......
9、.................................................................................................................... 11 6.本課題的意義 .........................................................................................
10、....................................... 11 第二章 儀器及材料 ................................................................................................................................. 12 1.主要儀器 .........................
11、............................................................................................................... 12 2.實(shí)驗(yàn)材料 .................................................................................................
12、....................................... 13 2.1 主要試劑 ............................................................................................................................ 13 2.2 質(zhì)粒、菌種和病毒株 ........................
13、................................................................................ 14 2.3 其他主要試劑配方 ............................................................................................................ 15 第三章 實(shí)驗(yàn)方法
14、..................................................................................................................................... 17 1.細(xì)胞培養(yǎng) ...........................................................................
15、............................................................. 17 1.1 細(xì)胞復(fù)蘇 ............................................................................................................................ 17 1.2 細(xì)胞傳代 .......
16、..................................................................................................................... 17 2.人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的培養(yǎng)與鑒定 ..............................................................................
17、........... 17 2.1 病毒培養(yǎng) ............................................................................................................................ 17 2.2 病毒培養(yǎng)的鑒定 ......................................................
18、.......................................................... 18 3.病毒感染細(xì)胞總 RNA 的抽提（TIANGEN 試劑盒） ..................................................................... 20 4.人巨細(xì)胞病毒(HCMV) RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA（TaKaRa）.................
19、...................................... 21 5.人巨細(xì)胞病毒(HCMV) RNA 純度鑒定的 PCR 擴(kuò)增 ................................................................. 22 6.UL148 基因表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 .....................................................
20、....................................... 23 6.1 引物設(shè)計(jì)： ....................................................................................................................... 23 6.2 PCR 釣取目的基因： ..........................
21、.............................................................................. 23 6.3 PCR 產(chǎn)物回收（DNA 凝膠回收試劑盒，DONGSHENG BIOTECH） ................................... 24 6.4 PCR 回收產(chǎn)物及載體雙酶切 ..................................
22、.......................................................... 25 6.5 酶切產(chǎn)物回收（DNA 凝膠回收試劑盒，DONGSHENG BIOTECH） .................................. 25 6.6 目段片段與載體連接： .............................................................
23、...................................... 26 6.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 ............................................................................................................... 26 6.8 重組質(zhì)粒 pET32a /UL148 的酶切鑒定 .....................
24、...................................................... 26 6.9 重組質(zhì)粒 pET32a /UL148 序列測定 ............................................................................... 27 7.蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá) ......................................
25、.................................................................................. 27 7.1 蛋白表達(dá) ............................................................................................................................
26、 27 7.2 表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析 ........................................................................................... 28 第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 ......................................................................................
27、................................... 29 1.病毒培養(yǎng)的鑒定 ............................................................................................................................ 29 1.1 細(xì)胞病變效應(yīng) ..............................
28、...................................................................................... 29 1.2 多重 PCR .......................................................................................................................
29、.... 30 2.HCMV 感染細(xì)胞后總 RNA 的提取結(jié)果 .................................................................................... 31 3.RNA 純度的鑒定 .......................................................................................
30、................................... 31 4.目的基因的獲取 ............................................................................................................................ 32 5.pET32a /UL148 重組質(zhì)粒的鑒定 ................
31、................................................................................. 33 5.1 雙酶切鑒定 ........................................................................................................................ 33
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