豬巨細胞病毒gB基因序列分析及原核表達.pdf

1、根據Genbank中豬巨細胞病毒DPOL基因序列設計了擴增片段大小為579bp的引物P1/P2，建立了檢測豬巨細胞病毒PCR方法。引物P1/P2從PCMV陽性DNA模板中擴增出特異性條帶的最低DNA含量為10-2 ng/mL。PCR產物經測序比對，發(fā)現(xiàn)與NCBI中已發(fā)表的豬巨細胞病毒OF-1株序列(AF268041)的同源性為99％。用該方法對全國11個省市地區(qū)豬場的100份臨床樣品進行了檢測。結果有33份樣品檢測出陽性，陽性率為33％

2、。
　　 應用PCR方法，從鄭州、福建、浙江金華和寧波豬肺臟中分別擴增出四段PCMV gB基因，并將其分別克隆入pMD18-T載體，經藍白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆進行序列分析并構建系統(tǒng)進化樹。序列分析表明，其gB基因全長為2580 bp，編碼860個氨基酸，與PCMV其他序列相比，其同源性在96.1％～99.7％，與β皰疹病毒亞科中其他常見毒株同源性在25.9％～38.1％:推導的氨基酸序列，有11個半胱氨酸，17個潛在N

3、-糖基化位點，其裂解位點是RYKR;系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，推導的氨基酸序列出現(xiàn)兩個分支，而且來自上述四個地區(qū)PCMV gB糖蛋白氨基酸序列處在不同的分支中。
　　 根據已發(fā)表的NB PCMV gB基因序列設計1對引物.擴增引物上下游分別帶有BamHI、XhoI酶切位點。PCR獲得目的片段，并將其克隆到pMD18-T載體。用相同的限制性內切酶酶切陽性重組質粒和表達載體pGEX-6P-1后，用T4DNA連接酶連接，構建重組表達載體pG