豬傳染性胃腸炎病毒SC-Y株M基因序列分析、原核表達(dá)研究及真核表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、本研究以TGEVSC-Y株的毒種為材料擴(kuò)增克隆M基因，并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；同時(shí)利用獲得的M基因進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)及真核表達(dá)載體構(gòu)建研究。主要研究結(jié)果如下： Ⅰ、參照GenBank中登錄號(hào)AJ271965的TGEV基因序列，利用自行設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，以ST細(xì)胞增殖培養(yǎng)的SC-Y株TGEV為材料，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出M基因，TA克隆構(gòu)建獲得其重組質(zhì)粒pMD18-TrM。序列分析顯示SC-Y株與GenBank中登

2、錄的TS、TFI、Purdue、Purdue-115、PUR46-MAD、96-133、HN2002、FS772/70、TO14株M基因核苷酸序列同源性達(dá)94％以上，氨基酸序列同源性達(dá)91％以上，表明不同毒株M基因保守性較高。M蛋白基因系統(tǒng)進(jìn)化及其氨基酸同源性分析顯示SC-Y株與美國(guó)Purdue株親緣關(guān)系較近，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)TS、TFI株分別與韓國(guó)HN2002株、英國(guó)FS772/70株親緣關(guān)系較近，而我國(guó)SC-Y、TS、TFI三株之間

3、親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)，這從一定程度上說(shuō)明我國(guó)TGEV可能為外國(guó)輸入性。M蛋白氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)綜合參數(shù)分析、信號(hào)肽及跨膜區(qū)預(yù)測(cè)顯示，SC-Y株M前體蛋白存在有四個(gè)跨膜區(qū)(氨基酸殘基位于1-16，53-75，86-104，113-135)，其中1-16位為信號(hào)肽序列；成熟M蛋白(去除信號(hào)肽)為三個(gè)跨膜區(qū)，其N端位于病毒膜外區(qū)，而C端位于病毒膜內(nèi)區(qū)。SC-Y株成熟M蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示其功能結(jié)構(gòu)域在N端主要集中于氨基酸殘基8-21，該區(qū)域與M蛋白的生

4、物學(xué)功能關(guān)系密切；預(yù)測(cè)綜合分析顯示可形成有效抗原表位的區(qū)域在N端氨基酸殘基4-30或其附近。 Ⅱ、以pMD18-TrM為材料，擴(kuò)增、TA克隆構(gòu)建獲得M蛋白去信號(hào)肽序列基因的重組質(zhì)粒pMD18-T△M。運(yùn)用DNA技術(shù)，將pMD18-TrM、pMD18-T△M中M蛋白基因及其去信號(hào)肽序列基因分別轉(zhuǎn)移定向克隆到pET32a(+)中，獲得重組原核表達(dá)載體pET32a(+)-rM、pET-32a(+)-△M。構(gòu)建成功后分別轉(zhuǎn)化高效表達(dá)菌株

5、E.coliBL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)研究。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，原核重組表達(dá)載體pET32a(+)-rM未成功表達(dá)出預(yù)期目的融合蛋白Trx-M；原核重組表達(dá)載體pET-32a(+)-△M表達(dá)出預(yù)期融合目的蛋白Trx-△M，其表達(dá)量有待進(jìn)一步研究；WesternBlotting檢測(cè)結(jié)果顯示，表達(dá)的去信號(hào)肽目的融合蛋白Trx-△M具有特異的生物學(xué)免疫原性。 Ⅲ、根據(jù)真核表達(dá)載體pEGFP-C1多克隆位點(diǎn)(MCS)特點(diǎn)設(shè)