豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白A、D基因與豬大腸肝菌LTB基因的重組、克隆及原核表達.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)引起的一種以嘔吐、脫水、嚴重腹瀉為主要特征的急性、高度接觸性傳染病。產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)是引起仔豬腹瀉的一種重要的腸道病原菌,能夠引起仔

2、豬黃痢和仔豬白痢等。根據(jù)GenBank中公布的TGEV的S蛋白A、D基因序列和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)基因序列,分別設(shè)計1對引物,采用RT-PCR技術(shù)擴增含A、D位點的S1基因和LTB基因,各自將其插入pET-28a(+)載體中構(gòu)建原核表達質(zhì)粒,并進行PCR、酶切鑒定及序列測定。重組菌經(jīng)誘導表達后,表達產(chǎn)物用SDS-PAGE和Western-blot進行檢測。
　　 RT-PCR擴增得到了S1基因片段,該基因全長9

3、80bp,編碼262個氨基酸,序列分析顯示S1基因與GenBank中公布的S1基因序列同源性達97％以上,氨基酸序列同源性達95％以上,表明不同毒株S1基因高度保守性。表達獲得的S1蛋白約33.7ku,并且表達產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在；Western-blot分析表明,表達的S1蛋白可以被TGEV陽性血清所識別,具有反應(yīng)原性。同樣,PCR擴增得到的LTB基因全長375bp,編碼124個氨基酸,序列分析顯示LTB基因與GenBank中公

4、布的LTB基因序列同源性達99％以上,氨基酸序列同源性達98％以上。表達獲得的LTB蛋白約14ku。Western-blot分析表明,LTB蛋白能被ETEC陽性血清所識別,具有反應(yīng)原性。
　　 重新設(shè)計1個引物,使LTB基因的終止密碼子TAG突變?yōu)門AC,且在其下游添加EcoRI酶切位點。另設(shè)計1個引物,在S1基因上游引入EcoRI酶切位點,并以上述試驗擴增的S1基因和LTB基因為模板,再次進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切和連接等