豬傳染性胃腸炎病毒TH-98株N基因在大腸桿菌中的表達(dá)及重組N蛋白的純化.pdf

1、該論文首次在中國(guó)對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒核衣殼蛋白基因進(jìn)行了克隆、鑒定、表達(dá)及重組核蛋白的純化;并在細(xì)胞上對(duì)重組核衣殼蛋白抗體的中和效力進(jìn)行了測(cè)定.主要結(jié)果如下:以豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)TH-98強(qiáng)毒株基因組mRNA為模版,根據(jù)文獻(xiàn)已發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒核蛋白(N)基因cDNA序列及載體pProEXHTb的多克隆酶切位點(diǎn)序列,設(shè)計(jì)和合成一對(duì)引物,以RT-PCR技術(shù),擴(kuò)增其N(xiāo)基因;將RT-PCR產(chǎn)物按正確的閱讀框架(ORF)定向克

2、隆到載體pProEXHTb上,重組質(zhì)粒PHN轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH<,5α>株,通過(guò)酶切分析及序列測(cè)定表明獲得了TGEV N基因的無(wú)性繁殖系.經(jīng)DNAStar軟件進(jìn)行序列分析表明:TH-98強(qiáng)毒株的N基因與參考毒株P(guān)urdue-115株、FS772/70株、T014株、96-1933株及TFI株的核苷酸序列的同源性分別為99﹪、97﹪、97﹪、95﹪、96﹪;氨基酸序列的同源性分別為99﹪、97﹪、98﹪、96﹪、97﹪,因此TGEV N基因

3、具有高度的保守性.根據(jù)載體pProEXHTb含有(His)<,6>特點(diǎn),將融合蛋白進(jìn)行純化,在純化過(guò)程中經(jīng)各項(xiàng)條件的探索,確定為在裂解液中含有1mM PMSF的條件下,分別經(jīng)過(guò)2倍體積的buffer A和buffer B洗脫后,再收集PH5.9,含有80mmol/L咪唑的1倍體積buffer C洗脫液,可得到純化的融合蛋白.將純化的融合蛋白免疫家兔,制備的抗血清在豬IBRS<,2>傳代細(xì)胞上進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示中和效價(jià)為1:22,表明