雞源志賀菌IpaC基因表達載體構建及其在畢赤酵母中的表達.pdf

1、志賀菌是腸道致病菌，感染后可以引起成年人和兒童腹瀉。以前人們一直認為志賀菌不能使畜禽致病，實際上，大量國內(nèi)外相關報道顯示志賀菌可以感染多種動物，例如豬、狐貍、獼猴、牛、雞、鴨等，感染后可引起腹瀉、腹痛嚴重者甚至導致死亡。近年來發(fā)現(xiàn)的雞志賀菌病是一種急性傳染病，可以引起不同日齡和不同品種的雞發(fā)生腹瀉，具有十分廣泛的流行性，不僅嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展，而且給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟的損失。因為志賀菌在人和多種動物之間可能存在十分廣泛的交叉感染，

2、這嚴重危害了人類公共衛(wèi)生和獸醫(yī)公共衛(wèi)生。
　　志賀菌侵襲腸上皮細胞是志賀菌致病的關鍵。大量研究顯示，志賀菌侵襲腸道過程中毒力大質(zhì)粒上Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的IpaC蛋白通過介導細胞骨架重排而使志賀菌趁機侵入腸上皮細胞，而且只有重組純化的IpaC蛋白才能夠在一定程度上恢復志賀菌的侵襲能力。在分子水平上，IpaC蛋白不同結(jié)構域具有不同生物學功能，IpaC蛋白N端的20個氨基酸與Ⅲ型分泌系統(tǒng)有關，中央疏水區(qū)兩個橫跨膜的螺旋線與磷脂膜滲透及蛋白

3、質(zhì)的穩(wěn)定有關，而IpaC蛋白C端則與觸發(fā)肌動蛋白有關。雞源志賀菌與人源志賀菌分泌的IpaC蛋白分子相同，分析其分子進化特性發(fā)現(xiàn)，這兩種不同物種來源的志賀菌IpaC蛋白進化起源相同。因此，通過酵母表達系統(tǒng)表達雞源志賀菌IpaC蛋白，保持IpaC蛋白的天然構象具有十分重要的意義。
　　本研究分別以雞源志賀菌IpaC基因原序列及根據(jù)酵母偏愛性密碼子優(yōu)化合成的IpaC*基因為研究對象，分別構建真核表達載體pGAPZαA-IpaC和pGAP

4、ZαA-IpaC*，轉(zhuǎn)化至酵母宿主菌X-33中成功實現(xiàn)了雞源志賀菌IpaC*基因在畢赤酵母中的胞內(nèi)表達。研究結(jié)果如下：
　　1.根據(jù)真核表達載體pGAPZαA多克隆位點及雞源志賀菌IpaC基因序列設計一對引物，以本實驗室保存重組載體pET32a-IpaC為模板，利用PCR技術擴增得到雞源志賀菌IpaC基因，與真核表達載體pGAPZαA同時雙酶切，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10中，經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切及測序鑒定，成功構建真核表達載

5、體pGAPZαA-IpaC。
　　2.真核表達載體pGAPZαA-IpaC經(jīng)單酶切線性化后，電擊法轉(zhuǎn)化至酵母宿主菌X-33中，挑取高抗性（Zeocin濃度為2000 ug/mL）YPD固體培養(yǎng)基的陽性克隆擴大培養(yǎng)，經(jīng)酵母基因組PCR擴增及序列測定鑒定正確后，挑取鑒定正確的重組酵母pGAPZαA-IpaC/X-33轉(zhuǎn)接至YPD液體培養(yǎng)基中表達，分別在不同時間點定時取樣，SDS-PAGE電泳及Western blot檢測，結(jié)果顯示，雞

6、源志賀菌IpaC基因原序列在重組酵母X-33胞內(nèi)和胞外均未表達。
　　3.在不改變IpaC蛋白氨基酸序列的情況下根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化合成雞源志賀菌IpaC*基因，將其克隆至酵母表達載體pGAPZαA中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10中，挑取鑒定正確的重組質(zhì)粒pGAPZαA-IpaC*轉(zhuǎn)化至酵母宿主菌X-33中，經(jīng)高抗篩選、PCR擴增及序列測定鑒定正確。挑取鑒定正確的克隆菌株轉(zhuǎn)接于YPD液體培養(yǎng)基中，不同時間點取樣，經(jīng)SDS-PA