血紅密孔菌漆酶的純化及其基因在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、漆酶(EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛分布于植物，真菌和細(xì)菌中。漆酶能催化降解許多有機(jī)和無機(jī)底物，在工業(yè)應(yīng)用和生物修復(fù)等方面具有廣泛的用途。血紅密孔菌是擔(dān)子菌綱、多孔菌科的一種白腐真菌，能組成型地分泌胞外漆酶。本文主要研究血紅密孔菌胞外漆酶的純化及其漆酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)。 通過超濾，DEAE-Sepharose FF離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過濾等純化技術(shù)對血紅密孔菌胞外漆酶進(jìn)行了純化

2、，最終純化倍數(shù)為3.61，總活力回收率為36.53％。純酶的分子量為61.4 kDa，在600 am處缺少典型的吸收峰，N端氨基酸序列與朱紅密孔菌漆酶的N端氨基酸序列完全一致，與其它木腐真菌產(chǎn)生的漆酶也有較高的相似性。以ABTS作為底物時血紅密孔菌純化后的漆酶的最適pH為3.0，在pH2.6～4.2之間維持較高的酶活，超過pH4.6漆酶活性急劇下降；純酶最適反應(yīng)溫度為65℃，在25℃時在pH2.0～5.0的緩沖液中保溫1 h較穩(wěn)定，在最

3、適pH下純酶在40℃以下較穩(wěn)定，超過50℃酶活下降較快。 純化后的漆酶能氧化不同的漆酶底物，包括ABTS，syringaldazine和2,6- Dimethoxyphenol。ABTS的米氏常數(shù)最小(0.077 mmol/L)，純酶對ABTS的催化效率最高，其它依次為syringaldazine和2,6-Dimethoxyphenol。幾種漆酶的抑制劑中0.1mmol/L的NaN<,3>和1 mmol/L半胱氨酸和二硫疏糖醇對

4、漆酶活力有強(qiáng)烈的抑制，而金屬離子螯合劑EDTA對漆酶活力的抑制程度較低。 染料降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血紅密孔菌純化后的漆酶對RBBR的降解不需要小分子介體物質(zhì)的參與且降解效果要好于其它白腐真菌來源的漆酶，在5 U/mL的酶活下只需10 min就可降解90％左右的葸醌染料RBBR。顯示了血紅密孔菌及其所產(chǎn)的漆酶在染料降解的應(yīng)用上具有很強(qiáng)的工業(yè)應(yīng)用潛力。 采用RT-PCR擴(kuò)增得到了漆酶的cDNA序列，膠回收純化后將其克隆到T載體上，測

5、序結(jié)果顯示克隆到的序列與血紅密孔菌漆酶基因的原始序列相比有所不同，導(dǎo)致了產(chǎn)物中有三個氨基酸序列發(fā)生改變。目的基因與表達(dá)載體pPICZB相連接構(gòu)建重組質(zhì)粒 pPICZB/lac后通過LiCl法轉(zhuǎn)化Pichia pastoris SMD1168H，重組菌利用Zeocin抗性平板篩選，采用菌落PCR進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒已經(jīng)插入到酵母基因組中。 重組菌在BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)了目的漆酶基因的分泌表達(dá)，菌體的密度隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增加