腈水解酶基因的修正及與透明顫菌血紅蛋白基因在畢赤酵母與煙草中的聯(lián)合表達.pdf

1、廣譜、非選擇性觸殺型除草劑溴苯腈主要用來清除田間闊葉類雜草,它的作用機理是能夠阻滯光合電子的傳遞,使植物光合作用受阻而致死.從土壤細菌中分離得到了一種以溴苯腈為氮源的菌株(Klebsiella ozaenae),它可以產(chǎn)生專一的溴苯腈水解酶,將溴苯腈轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒的3,5-二溴-4-羥基苯甲酸.編碼此酶的bxn基因也已經(jīng)被克隆,并在小麥、油菜等植物中成功表達.該實驗室通過協(xié)議獲得攜帶bxn基因表達盒的質(zhì)粒RD127,但連續(xù)兩年轉(zhuǎn)化棉花未果,

2、分析序列發(fā)現(xiàn)存在4處變異.故該實驗首先采用PCR法對bxn基因的突變點進行了回復突變,并借助酵母表達體系檢驗回復突變后的基因是否具有腈水解酶活性.來源于貧氧環(huán)境中的一種專性好氧菌Vitreoscilla的血紅蛋白能夠在極低的溶氧(5%)條件下促進生物體的生長.經(jīng)過密碼子優(yōu)化的透明顫菌血紅蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene)可以提高真核生物的產(chǎn)量、增加其生長速度該實驗室已經(jīng)證實,故在該實驗中被應(yīng)用.在酵母實

3、驗中,對Invitrogen公司的巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)進行了創(chuàng)新性應(yīng)用:只用一種分泌型表達載體構(gòu)建了可以同時在酵母胞內(nèi)和胞外分泌表達的載體pPIC9K-vgbbxn.此載體轉(zhuǎn)化酵母后,通過PCR、SDS-PAGE檢測證實兩基因已經(jīng)很好地整合進酵母基因組且能高效表達,以及用準確的酶活測定方法成功地檢測到二者所表達的產(chǎn)物均具有正常的酶活性.貧氧條件下對菌體的生長速度和密度進行了實驗檢測,發(fā)現(xiàn)在貧氧環(huán)境中vgb基因可以基本保證畢赤酵母的生長

4、;同時,對bxn基因的產(chǎn)物腈水解酶也進行了檢測,發(fā)現(xiàn)在vgb基因的存在下即使在貧氧中仍能保證腈水解酶的正常表達且還可能過量表達.接下來通過借助pG Ω 4A中間載體構(gòu)建了兩種植物表達載體pBI121-vgbbxn(一種是vgb和bxn均由35S啟動子啟動;另一種是bxn由RuBP啟動子啟動,vgb由35S啟動子啟動),利用農(nóng)桿菌介導法將兩種植物表達載體導入煙草基因組.通過對煙草基因組的PCR鑒定和轉(zhuǎn)基因煙草的溴苯腈除草劑抗性檢測證實:b