靈芝發(fā)酵液改善饅頭品質(zhì)的機(jī)制及漆酶基因在畢赤酵母內(nèi)的異源表達(dá).pdf

1、漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶，能作用的底物非常廣泛。漆酶能夠催化氧化多種芳香族和非芳香族化合物使之生成相應(yīng)的苯醌，同時把氧還原為水。目前研究表明，漆酶在造紙工業(yè)、食品加工、廢水處理、土壤凈化、染料脫色、生物傳感器和免疫檢測等方面都具有廣泛的應(yīng)用前景和較高的研究價值。
　　本論文利用單因素試驗法對影響Ganoderma lucidum HSD06B液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的因素進(jìn)行優(yōu)化，得到菌株HSD06

2、B發(fā)酵產(chǎn)漆酶的最佳培養(yǎng)基配方為:葡萄糖50 g/L，酵母膏20 g/L，藜蘆醇0.7 mmol/L，KH2PO41g/L，CuSO4·5H2O0.4 mmol/L，麩皮15 g/L。菌株HSD06B利用該培養(yǎng)基在28℃、180 rpm、接種量10％的條件下發(fā)酵，第7天時漆酶酶活達(dá)到最高，為16540 U/L，比優(yōu)化前提高了3.39倍。
　　靈芝漆酶粗酶液聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)實驗表明，G.lucidum HS

3、D06B漆酶包含三種同工酶，分別為Lac1、Lac2、Lac3。G.lucidum HSD06B漆酶酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明:該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，低于60℃保溫1h仍能保存80％以上的酶活，具有良好的熱穩(wěn)定性，最適反應(yīng)pH為4.5，在pH4.5-7.0時保溫3h仍能保存80％以上的活力;金屬離子Ca2+和Cu2+對漆酶酶活具有一定的激活作用，Cu2+的激活作用最為顯著;K+、Mg2+、Na+、Mn2+、Fe2+和Zn2+對漆酶酶活有

4、一定的抑制作用;米氏常數(shù)Km為1.852 mmol/L。
　　初步研究了靈芝發(fā)酵液對饅頭品質(zhì)的影響及其改善饅頭品質(zhì)的機(jī)制。結(jié)果表明靈芝發(fā)酵液可以改善饅頭的比容，當(dāng)發(fā)酵液添加量為100μL/g時，饅頭的比容最大，為2.257mL/g;靈芝發(fā)酵液對饅頭的氣孔也有一定的改善作用，發(fā)酵液添加量為25μL/g時，氣孔數(shù)達(dá)到最多，為1566，但是，隨著添加量的繼續(xù)增加，饅頭的氣孔面積則不斷增大，至100μL/g時，氣孔面積達(dá)到最大，為416.

5、2 mm2;質(zhì)構(gòu)分析表明靈芝發(fā)酵液能增加饅頭的硬度和咀嚼性，當(dāng)發(fā)酵液添加量為50μL/g時，饅頭的硬度和咀嚼度達(dá)到最高，分別為1998g和1579。靈芝發(fā)酵液中含有淀粉酶，淀粉酶能催化淀粉生成葡萄糖和麥芽糖，饅頭發(fā)酵劑中的酵母菌利用葡萄糖和麥芽糖為碳源進(jìn)行生長代謝會釋放CO2，進(jìn)而導(dǎo)致饅頭的體積增大，比容也隨之增加;同時，也會導(dǎo)致饅頭氣孔數(shù)和氣孔面積的變化，饅頭的氣孔數(shù)和氣孔面積隨著發(fā)酵液添加量的增大逐漸增加，但是當(dāng)發(fā)酵液添加量高于25

6、μL/g時，淀粉酶活力過高，導(dǎo)致氣孔數(shù)逐漸減少了，但是氣孔卻變大了，最終氣孔面積變大;饅頭的硬度和咀嚼度是由面粉中淀粉酶的作用、蛋白交聯(lián)、淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例共同決定的，其中發(fā)酵液中漆酶催化蛋白交聯(lián)、發(fā)酵液催化支鏈淀粉轉(zhuǎn)化為直鏈淀粉可以導(dǎo)致硬度和咀嚼度增大，上述發(fā)酵液中淀粉酶的作用會導(dǎo)致硬度和咀嚼度的降低，當(dāng)發(fā)酵液添加量≤50μL/g，前者占據(jù)主導(dǎo)作用，所以硬度和咀嚼度逐漸增大，發(fā)酵液添加量＞50μL/g時，淀粉酶活力較高，其

7、影響作用占據(jù)主導(dǎo)，饅頭硬度和咀嚼度逐漸減小，以上結(jié)果說明靈芝發(fā)酵液能顯著改善饅頭品質(zhì)。
　　對靈芝漆酶基因進(jìn)行克隆，經(jīng)測序Lac基因編碼區(qū)基因長度為1563 bp。對Lac基因密碼子進(jìn)行酵母偏好性改造，使漆酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)水平在理論上得到顯著提高。將改造后的Lac基因連接到表達(dá)載體pPIC9K上，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-Lac，通過LiCl轉(zhuǎn)化法成功將改造后的Lac基因?qū)氡磉_(dá)菌株畢赤酵母體內(nèi)。Lac基因在畢赤酵母體內(nèi)的