單純皰疹病毒Ⅰ型糖蛋白G基因片段的克隆表達及其表達產(chǎn)物單克隆抗體的制備.pdf

1、單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)為皰疹病毒科的典型代表，分為HSV-I和HSV-II兩種血清型。HSV-I是散發(fā)性腦炎和角膜炎常見的病因。HSVI感染對于免疫抑制患者(妊娠期婦女)和新生兒可以引起嚴重的并發(fā)癥。由于缺乏有效的預防措施，HSV-I感染妊娠期婦女的早期有效的診斷對于阻斷垂直傳播尤其重要。目前，HSV-I抗體的檢測是臨床上最常用的檢測HSV-I感染的方法。 為提高HSV-I抗體檢測的靈敏

2、性、特異性和準確性，我們擬制備HSV-I型特異性包膜糖蛋白G(gGI)的重組蛋白抗原及其相應(yīng)的單克隆抗體(McAb)，并將其用于相應(yīng)ELISA檢測試劑盒，以促進HSV-I型特異性血清學檢測的進一步發(fā)展。圍繞上述目的，我們進行了如下研究工作： 一、gGI基因片段的克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中已公布的HSV-I不同毒株gGI基因序列的同源部分，用軟件自行設(shè)計一對引物，用此引物對目的基因片段進行PCR擴增，產(chǎn)物包

3、含了gGI免疫優(yōu)勢氨基酸序列(第112～127aa)的對應(yīng)基因片段，然后對純化的PCR產(chǎn)物與pGEX-4T-1載體質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I進行雙酶切并純化回收，隨后對回收產(chǎn)物進行連接，構(gòu)建pGEX-4T-1/gGI重組質(zhì)粒，并對重組質(zhì)粒進行篩選鑒定，最終獲得內(nèi)含高度保守目的基因片段的重組質(zhì)粒。 二、GST/gGI融合蛋白的表達純化及特性鑒定 將pGEX-4T-1/gGI重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主大腸桿菌BL2

4、1(DE3)，然后用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測驗證后，對存在于超聲離心后上清液中的融合蛋白用親和層析技術(shù)進行純化，并用ELISA間接法對純化的GST/gGI融合蛋白的特性進行鑒定，最終獲得保留天然蛋白抗原性和特異性的重組蛋白。 三、gGI重組蛋白單克隆抗體的制備 經(jīng)動物免疫后，參考抗體效價挑選合適的BALB/c鼠進行了細胞融合，并于適當時機對雜交瘤細胞進行篩選，遺憾的是