人皰疹病毒6型101K被膜蛋白表達克隆的構建及應用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的 構建人皰疹病毒6型(HHV-6)101K被膜蛋白的原核高效表達克隆,制備用于活動性HHV-6感染血清學診斷的基因工程抗原.方法 應用細胞培養(yǎng)技術從臨床唾液標本分離HHV-6毒株,出現細胞病變者用HHV-6特異性引物及限制性酶切分析法進行初步鑒定;PCR擴增HHV-6B 101K被膜蛋白主要抗原決定簇區(qū)(666~834aa)編碼基因片段(nt2347~2853),并導入T載體進行測序,與Genebank標準毒株序列比較以進一步鑒定.

2、目的基因及表達載體pThioHis A分別經雙酶切后連接,轉化宿主菌E.coli BL21,IPTG誘導蛋白表達,表達產物經鎳-敖合物瓊脂糖樹脂柱親和層析初步純化,以Western-Blot鑒定其抗原性和特異性.用純化重組蛋白包被ELISA反應板,檢測197份血清中HHV-6 IgM抗體,與間接免疫熒光(IFA)檢測的結果進行比較,同時檢測15份HCMV陽性血清,以分析重組蛋白的特異性.結果 PCR擴增獲得的目的基因序列與Geneban

3、k中HHV-6B標準毒株Z29序列一致.HHV-6 101K融合蛋白可在E.coli BL21中有效表達,表達產物為硫氧還(HP-thioredoxin)融合蛋白,純化后獲得單一目的蛋白條帶.West-ern-blot檢測結果表明該融合蛋白可與12份HHV-6 IgM陽性血清中的10份(83.3％)發(fā)生反應,而與8份陰性血清均不發(fā)生反應.用該融合蛋白包被ELISA反應板,檢測197份血清中HHV-6 IgM抗體,與IFA檢測血清IgM抗

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