依賴hTERT啟動子的新型溶瘤單純皰疹病毒的構(gòu)建和功能研究.pdf

1、背景:近20年來，溶瘤病毒療法已經(jīng)被證實是一種新型有效的腫瘤治療策略。如腺病毒、單純皰疹病毒和新城疫病毒等溶瘤病毒能夠在腫瘤細胞中復制增殖并直接殺傷腫瘤細胞。目前，毒性過高仍然是溶瘤病毒應用中的主要障礙。為解決此問題，我們構(gòu)建了一種新型溶瘤單純皰疹病毒oHSV1_hTERTp_ICP4，該病毒基因組中關(guān)鍵復制基因ICP4由腫瘤特異性啟動子hTERT啟動子調(diào)控，這使得重組新病毒可以選擇性地在腫瘤細胞復制增殖，其安全性得到大幅度提高。并且，

2、我們通過體內(nèi)外實驗評估了oHSV1_hTERTp_ICP4的溶瘤活性和腫瘤特異性。
　　 方法:本研究主要通過質(zhì)粒構(gòu)建和同源重組技術(shù)完成重組新病毒oHSV1_hTERTp_ICP4和兩種具有示蹤作用的病毒oHSV1_hTERTp_ICP4_CMVpeGFP和oHSV1_hTERTp_ICP4_CMVp_Luc2的構(gòu)建工作;通過CCK-8細胞增殖實驗檢測oHSV1_hTERTp_ICP4對多種腫瘤和正常細胞系的殺傷能力;通過滴度測

3、定方法檢測oHSV1_hTERTp_ICP4在多種細胞系中的增殖情況;通過流式細胞術(shù)和激光共聚焦技術(shù)明確oHSV1_hTERTp_ICP4對正常人血細胞的感染復制情況;通過動物實驗初步評價oHSV1_hTERTp_ICP4在BGC823腫瘤模型中的抗腫瘤效果，并使用oHSV1_hTERTp_ICP4_CMVp_Luc2示蹤檢測新病毒在荷瘤裸鼠中不同組織內(nèi)的復制表達情況;通過實時定量PCR實驗檢測oHSV1_hTERTp_ICP4感染細胞

4、后對hTERT啟動子活性的影響;最后通過AnnexinV+PI雙染法檢測oHSV1_hTERTp_ICP4的細胞毒作用與細胞壞死和凋亡間的關(guān)系。
　　 結(jié)果:(1)本研究成功構(gòu)建了含有hTERT啟動子的新病毒oHSV1_hTERTp_ICP4及具有示蹤作用的病毒 oHSV1_hTERTp_ICP4_CMVp_eGFP和oHSV1_hTERTp_ICP4_CMVp_Luc2。(2) oHSV1_hTERTp_ICP4在端粒酶陽性腫

5、瘤細胞系中顯示出與原病毒oHSV1-17+相似的溶瘤活性;并且在端粒酶陰性細胞系中，沒有造成明顯的損傷（正常劑量MOI=0.1，1），而oHSV1-17+卻顯示出了明顯的殺傷作用。另外，我們發(fā)現(xiàn)oHSV1_hTERTp_ICP4在多種細胞中的增殖能力和細胞毒作用具有一致性。(3)經(jīng)流式檢測，在正常人血細胞中oHSV1-17+-GFP感染后出現(xiàn)了少量的綠色熒光細胞，而oHSV1_hTERTp_ICP4_CMVp_eGFP感染后幾乎沒有綠色

6、熒光細胞被發(fā)現(xiàn);另外，激光共聚焦結(jié)果顯示新病毒只在摻雜入的腫瘤細胞中顯著增殖，而在正常細胞中未發(fā)生顯著增殖，以上結(jié)果表明新病毒在正常人血細胞中具有良好的安全性。(4)在荷BGC823腫瘤裸鼠模型中，oHSV1_hTERTp_ICP4顯示出了與oHSV1-17+相似的抑瘤效果，但在生存期上卻明顯優(yōu)于后者;小鼠活體成像結(jié)果顯示oHSV1_hTERTp_ICP4CMVp_Luc2在荷BGC823腫瘤裸鼠的腫瘤內(nèi)能長期存活，而在肌肉和皮下組織內(nèi)

7、則被迅速清除。(5)在病毒感染端粒酶陰性的Saos-2骨肉瘤細胞后，hTERT mRNA表達上升，說明病毒感染可能會造成hTERT啟動子活性上升，然而病毒在該細胞中未能顯著復制，以及產(chǎn)生明顯的細胞毒作用，從另一方面表明該病毒對端粒酶陰性的正常細胞是安全的。隨后我們檢測了三個與hTERT啟動子活性相關(guān)的細胞因子c-myc、Sp1和E2F1在oHSV1_hTERTp_ICP4感染后的表達變化，發(fā)現(xiàn)只有E2F1 mRNA在病毒感染后較對照組大

8、幅下降，結(jié)果暗示其可能與hTERT啟動子活性變化有關(guān)。(6)端粒酶陽性BGC823細胞在被oHSV1_hTERTp_ICP4感染后壞死細胞比例對凋亡細胞比例的比值隨感染劑量的增加而升高，結(jié)果提示病毒的細胞毒作用以裂解細胞造成細胞壞死為主。
　　 結(jié)論:本研究首次在單純皰疹病毒中應用hTERT啟動子，構(gòu)建出新型溶瘤單純皰疹病毒oHSV1_hTERTp_ICP4。該病毒在體內(nèi)外實驗中被證明是一種安全性更好且具有良好溶瘤活性的新型溶瘤