重組hTERT啟動子啟動CD基因慢病毒載體構(gòu)建及電穿孔法包裝慢病毒顆粒.pdf

1、骨髓干細胞(BMSCs)由于具有橫向分化能力和跨胚層發(fā)育潛能等優(yōu)勢而被用于多種疾病的治療。隨著BMSCs移植的臨床實驗的增多，越來越多的文獻表明BMSCs經(jīng)過體外培養(yǎng)后有部分細胞不可避免地要發(fā)生瘤變。為充分開發(fā)BMSCs的臨床治療潛力，必需對人體骨髓干細胞移植進行生物安全性研究。
　　 目的：構(gòu)建用于真核細胞表達的重組慢病毒載體pLenti-hTERT-eGFP-ires-CD，并包裝成慢病毒顆粒，為進一步篩選可控移植骨髓干細胞

2、，研究骨髓干細胞移植瘤變打下基礎(chǔ)。
　　 方法：1.根據(jù)GeneBank中大腸桿菌CD基因序列和本實驗室保存的慢病毒載體pLenti-hTERT-eGFP設(shè)計合成分別引入Xho I和BamH I酶切位點的上下游引物，以大腸桿菌基因組為模板擴增CD基因，克隆到pLenti-hTERT-eGFP中得到pLenti-hTERT-CD質(zhì)粒。然后將Telve-C002中Luci-ires片段酶切克隆到pLenti-hTERT-CD中得到質(zhì)

3、粒pLenti-hTERT-Luci-ires-CD。根據(jù)pLenti-hTERT-eGFP上eGFP的基因序列設(shè)計引入Smal和Xbal酶切位點的上下游引物擴增eGFP，克隆到pLenti-hTERT-Luci-ires-CD替換Lcuirise基因得到重組慢病毒載體pLenti-hTERT-eGFP-ires-CD。
　　 2.用電穿孔法將重組慢病毒載體pLenti-hTERT-eGFP-ires-CD和包裝質(zhì)?；旌衔锕厕D(zhuǎn)染

4、來源于人胚腎細胞系的293T細胞，探討各個質(zhì)粒分子量對包裝的影響，確定電穿孔包裝病毒時各個質(zhì)粒的質(zhì)量比，建立慢病毒包裝體系。
　　 3.用收集濃縮的病毒上清液系列稀釋后感染Hela細胞，通過熒光定量PCR測定病毒滴度。
　　 結(jié)果：1.成功克隆有Xho I和BamH I酶切位點且始密碼子為ATG的大小為1359bp的CD基因DNA片段并成功構(gòu)建攜帶CD基因重組慢病毒載體pLenti-hTERT-eGFP-ires-CD。