溶瘤性單純皰疹病毒G47Δ對人乳腺癌等惡性腫瘤治療作用的研究.pdf

1、目的：
　　 溶瘤性單純皰疹病毒可以感染腫瘤細(xì)胞并在其內(nèi)復(fù)制，通過直接的細(xì)胞毒作用殺滅腫瘤細(xì)胞，死亡的腫瘤細(xì)胞釋放大量病毒從而感染其他細(xì)胞。G47△為第三代溶瘤性單純皰疹病毒載體，它的γ34.5和α47基因均有缺失，并且在ICP6基因(編碼核糖核酸還原酶大亞基)區(qū)插入E.coli lacZ導(dǎo)致其失活。本研究旨在探討溶瘤性單純皰疹病毒G47△對人乳腺癌細(xì)胞、乳腺永生化細(xì)胞及原代培養(yǎng)的正常乳腺細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)，并構(gòu)建了乳腺癌肺轉(zhuǎn)移動(dòng)

2、物模型，評估G47△對轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療作用，同時(shí)研究G47△對鼻咽癌、肝癌及甲狀腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)及對鼻咽癌皮下移植瘤模型的治療作用。
　　 材料與方法：
　　 第一部分：溶瘤性單純皰疹病毒G47△對人乳腺癌治療作用
　　 體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231、ZR-75-1、乳腺永生化細(xì)胞MCF-10A、76N-tert及原代培養(yǎng)正常乳腺細(xì)胞HMEC1和

3、HMEC2，將G47△按不同滴度(MOI)加入培養(yǎng)液中，每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。G47△含有LacZ基因，采用X-gal染色檢測被G47△感染的細(xì)胞中LacZ基因而證實(shí)病毒的存在。通過Balb-c裸鼠尾靜脈注射人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435構(gòu)建乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型，21日后病毒治療組每周兩次尾靜脈注射2×107pfu G47△，共四次，空白對照組只注射病毒懸液。60天后處死兩組裸鼠，取肺行印度墨汁染色后計(jì)數(shù)其表面結(jié)節(jié)數(shù)。
　　 第

4、二部分：溶瘤性單純皰疹病毒G47△對人鼻咽癌、肝癌、甲狀腺癌的治療作用
　　 體外培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞(SUNE1、CNE2)、人肝癌細(xì)胞(HEP-G2、HEP-3B、.BEL7405)及人甲狀腺癌細(xì)胞(ARO、FRO、WRO、KAT-5)，將G47△按不同滴度(MOI)加入培養(yǎng)液中，每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。采用X-gal染色檢測被G47△感染的細(xì)胞中LacZ基因而證實(shí)病毒的存在。通過Balb-c裸鼠尾雙側(cè)皮下注射人鼻咽癌細(xì)胞CNE

5、2構(gòu)建鼻咽癌皮下模型，在腫瘤直徑約5mm時(shí)，病毒治療組每3天左側(cè)皮下瘤內(nèi)注射1×106pfu G47△，共兩次，空白對照組只注射病毒懸液。游標(biāo)卡尺測量腫瘤直徑并計(jì)算腫瘤體積(V=a×b2/2)。腫瘤最大直徑達(dá)18mm時(shí)處死裸鼠，比較兩組裸鼠腫瘤大小。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分。溶瘤性單純皰疹病毒G47△對人乳腺癌治療作用G47△對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3及乳腺永生化細(xì)胞76N-te

6、rt有較強(qiáng)的殺傷能力。MOI=0.01及MOI=0.1的實(shí)驗(yàn)組，感染病毒后第5天，分別有超過85％和95％的細(xì)胞已被殺滅；但正常乳腺原代培養(yǎng)細(xì)胞不受病毒影響，感染病毒后第5天仍無細(xì)胞被殺滅。G47△對乳腺永生化細(xì)胞MCF-10A的細(xì)胞毒效應(yīng)較上述腫瘤細(xì)胞略輕微，MOI=0.1的實(shí)驗(yàn)組，感染病毒后第5天，僅有24.5％的細(xì)胞被殺滅。兩株人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及ZR-75-1不受病毒影響，感染病毒后第5天仍無細(xì)胞被殺滅。被病毒感染

7、的腫瘤細(xì)胞可經(jīng)X-gal染色檢測從而證實(shí)病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和傳播。在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型中，病毒治療組裸鼠平均肺表面結(jié)節(jié)數(shù)僅為1，對照組平均肺表面結(jié)節(jié)數(shù)為10。
　　 第二部分：溶瘤性單純皰疹病毒G47△對人鼻咽癌、肝癌、甲狀腺癌的治療作用G47△對人肝癌細(xì)胞HEP-G2及HEP-3B有較強(qiáng)的殺傷能力。MOI=0.01及MOI=0.1的實(shí)驗(yàn)組，感染病毒后第5天，分別有超過95％和100％的細(xì)胞被殺滅；但人肝癌細(xì)胞BEL-7405對G

8、47△的敏感程度較差，MOI=0.1的實(shí)驗(yàn)組，感染病毒后第5天，僅有32.5％的細(xì)胞被殺滅。人鼻咽癌細(xì)胞CNE2與SUNE1對G47△反應(yīng)較敏感，MOI=0.01及MOI=0.1的實(shí)驗(yàn)組，感染病毒后第5天，分別有超過85％和95％的細(xì)胞被殺滅。人甲狀腺癌細(xì)胞對G47△的敏感性略遜于上述細(xì)胞，MOI=0.01及MOI=0.1的實(shí)驗(yàn)組，感染病毒后第5天，ARO分別有69.6％和93.9％的細(xì)胞被殺滅，F(xiàn)RO分別有33.3％和100％的細(xì)胞被

9、殺滅，WRO分別有11.1％和37.8％的細(xì)胞被殺滅，KAT-5分別有38.7％和83.9％的細(xì)胞被殺滅。在鼻咽癌裸鼠皮下模型中，實(shí)驗(yàn)組病毒治療側(cè)腫瘤生長緩慢最終完全消退，對照側(cè)及腫瘤組腫瘤生長迅速，于接種后第21天長至18mm。
　　 結(jié)論：
　　 近期構(gòu)建的溶瘤性單純皰疹病毒載體G47△可有效殺傷人乳腺癌細(xì)胞、乳腺永生化細(xì)胞、鼻咽癌、肝癌及甲狀腺癌細(xì)胞，但對正常細(xì)胞無影響，尾靜脈注射G47△可有效治療肺轉(zhuǎn)移乳腺癌，瘤