攜帶XAF1的復(fù)制型溶瘤腺病毒治療惡性腫瘤的研究.pdf

1、腫瘤治療的瓶頸之一是靶向性問題。對(duì)腫瘤組織的靶向性可以提高基因治療的效果，避免對(duì)正常組織的損傷，并且能降低作為載體的微生物對(duì)機(jī)體的危害。條件復(fù)制型腺病毒是一類很有前景的抗腫瘤藥物，它們能特異性的在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制、增殖，從而殺死腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞毒性很小。構(gòu)建腫瘤特異性增殖病毒的方法之一是將病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制必需的，而在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制不需要的基因去除。ONYX-015就是基于此原理構(gòu)建的一種條件復(fù)制型腺病毒。通過剔除腺病毒的E1B5

2、5kD基因，使病毒只能在p53途徑失活的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。E1B55kD蛋白是腺病毒的早期基因編碼的蛋白，能夠與細(xì)胞中的p53蛋白結(jié)合從而抑制其功能。p53是宿主細(xì)胞抗腺病毒的主要蛋白。正常細(xì)胞受腺病毒感染后立即激活p53，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使得腺病毒不能再增殖，從而避免病毒擴(kuò)散到臨近組織。由于腺病毒E1B55kD蛋白能夠抑制p53的功能，大多數(shù)正常細(xì)胞感染腺病毒后并沒有立即出現(xiàn)凋亡，腺病毒仍然能夠在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。因此E1B55kD蛋白是腺

3、病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制所必需的。而p53途徑缺陷的腫瘤細(xì)胞被腺病毒感染后，p53不能被激活，因此缺失E1B55kD蛋白的腺病毒不能在正常細(xì)胞中復(fù)制，而能在P53失活的腫瘤細(xì)胞中大量復(fù)制和增殖，最終裂解腫瘤細(xì)胞并釋放新的病毒去感染臨近的腫瘤細(xì)胞以消滅腫瘤。 ONYX-015聯(lián)合化療臨床研究曾經(jīng)取得很好的效果，但單獨(dú)使用ONYX-015則療效很差，只有15-20％。為了克服這一缺點(diǎn)，本組提出一種腫瘤治療新策略：在腫瘤特異性增殖病毒中加

4、入抗癌基因，將腫瘤的基因治療與病毒治療各自的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來，即腫瘤的基因病毒治療。我們構(gòu)建了一種類似于ONYX-015的溶瘤腺病毒載體ZD55，值得注意的是ZD55含有一個(gè)BglⅡ克隆位點(diǎn)，可在此插入抗癌基因的表達(dá)框。這一系統(tǒng)在體外多種腫瘤細(xì)胞中顯示出與ONYX-015相似的特異性殺傷效率和復(fù)制效率。重要的是，它攜帶的外源基因的表達(dá)量能隨著病毒的復(fù)制和增殖大大提高。 XAF1是經(jīng)酵母雙雜交分析而發(fā)現(xiàn)的能通過其鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)與XIAP結(jié)

5、合的基因。XIAP(X-linkedInhibitorofApoptosis)是IAP(InhibitorofApoptosis)家族效力最強(qiáng)的成員，它可直接結(jié)合caspase-3,caspase-7和caspase-9從而抑制caspase的激活和細(xì)胞的死亡。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，XAF1能拮抗XIAP的anti-caspase作用，阻斷XIAP對(duì)凋亡的抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)它在正常細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在許多腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量卻很低甚至檢測(cè)不到。這些特

6、征說明它很可能是一種抗癌基因。雖然XAF1本身并不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但可以使腫瘤細(xì)胞對(duì)其他的死亡信號(hào)敏感。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平，發(fā)現(xiàn)它與TRAIL，TNFα，表鬼臼素合用能大大增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。ZD55病毒復(fù)制晚期，即可誘導(dǎo)溫和的細(xì)胞死亡。因此，我們將帶有HAtag的XAF1表達(dá)框插入條件復(fù)制腺病毒ZD55中，以ZD55作為細(xì)胞死亡的誘發(fā)劑，分析XAF1的插入是否可以增強(qiáng)ZD55原本的細(xì)胞毒效應(yīng)。 因?yàn)镋1B55kD的缺失，ZD55-XAF

7、1能特異性的在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，不在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，其復(fù)制能力與ONYX-015類似，插入外源基因并不影響其復(fù)制的特異性，也不降低它的復(fù)制能力。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，即使在MOI僅為0.1的情況下，ZD55-XAF1也能誘導(dǎo)強(qiáng)大的腫瘤特異性的細(xì)胞毒效應(yīng)。而且，在荷SW620人結(jié)腸癌的裸鼠模型中，ZD55-XAF1顯示出遠(yuǎn)高于非增殖腺病毒Ad-XAF1和單病毒ONYX-015的抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力。該治療組的八只小鼠中，四只的腫瘤完全消退。這些說

8、明，ZD55病毒治療與XAF1基因治療的聯(lián)合，有望成為一種新的有效的抗腫瘤試劑。 我們初步研究了ZD55-XAF1抗癌作用的機(jī)制。ZD55-XAF1感染的細(xì)胞顯示出明顯的細(xì)胞凋亡特征，然而與典型凋亡不同的是，它誘導(dǎo)的凋亡不依賴于caspase的激活。在ZD55-XAF1的作用下，Caspase-3和PARP均沒有表現(xiàn)出很強(qiáng)的切割現(xiàn)象。加入泛caspase的抑制劑不能抑制ZD55-XAF1誘導(dǎo)的凋亡，卻能抑制ZD55-TRAIL誘