攜帶rIL-10復制缺陷型重組腺病毒rMSC的構建.pdf

1、膿毒癥是一個世界范圍內(nèi)的醫(yī)學難題，其發(fā)病率不斷上升，死亡率高居不下。它是一個涉及大量局部和全身性炎癥反應以及凝血溶血等系統(tǒng)的復雜病理綜合征，其發(fā)病亦涉及諸多環(huán)節(jié)和機制。以往針對膿毒癥有諸多治療方法，但效果不盡人意。因此，必須尋找一種更理想的治療手段。 目前，有關細胞因子的基因治療已成為研究熱點之一。膿毒癥中炎癥因子發(fā)生的平衡紊亂使得以其為靶點的膿毒癥治療成為一種更具有吸引力的治療策略。研究顯示，IL-10是一種強有力的抗炎因子，

2、并通過多種途徑發(fā)揮抗炎作用。感染時過度表達的炎癥細胞因子在機體炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的決定性作用。IL-10的這種能夠抑制炎癥細胞因子的特性使其在膿毒癥、ARDS、風濕性關節(jié)炎和炎癥性腸病等炎性疾病中的應用成為可能，并在抑制炎癥反應、促進疾病轉歸中發(fā)揮了重要作用。因此，我們亦選擇IL-10作為本研究的靶基因，進行針對膿毒癥基因治療的動物體內(nèi)實驗。另外，MSC具有取材方便、多向分化潛能、可植入性以及便于外源基因的轉染和調(diào)控等優(yōu)勢而

3、成為目前許多基因治療研究所選用的細胞載體，也為本研究所選用。與以重組腺病毒直接回輸體內(nèi)相比，MSC作為載體可增加組織特異性、減少宿主免疫反應并延長目的基因的表達時間。 本研究中，我們利用具有高轉染率的腺病毒介導靶基因rIL-10至rMSC中，隨后檢測rMSC中外源基因的表達情況，為后續(xù)的動物體內(nèi)實驗奠定基礎。目的： 1構建載有大鼠白細胞介素10(ratinterleukine-10，rIL-10)重組腺病毒的大鼠骨髓間充

4、質干細胞(bonemesenchymalstemcellofrat，rMSC)并觀察外源基因在細胞中的表達情況。 2為后續(xù)的動物體內(nèi)實驗奠定基礎，以探討含有rIL-10的rMSCs對膿毒癥的影響。 方法1采用RT-PCR的方法從健康SD大鼠新鮮脾臟組織中提取出的總RNA中克隆rIL-10基因，于HindⅢ/SalⅠ位點亞克隆入腺病毒穿梭載體成為pAdTrack-CMV.rIL-10；PmeⅠ將其線性化后與腺病毒基因組載體

5、pAdEasy-1共轉染E.coliBJ5183而同源重組為pAd.rIL-10；再經(jīng)PacⅠ酶切后轉染HEK-293細胞進行重組腺病毒的包裝，利用Westernblotting和RT-PCR的方法鑒定。經(jīng)反復感染HEK-293對重組腺病毒進行大規(guī)模擴增純化后，獲得的病毒滴度為6.0×1010pfu/mL。 2無菌操作下取健康SD大鼠脛骨和腓骨骨干，獲得骨髓細胞。利用密度梯度離心法和貼壁法二者結合來分離并體外培養(yǎng)擴增大鼠骨髓間充

6、質干細胞(rMSC)，培養(yǎng)至多代并使用流式細胞儀對第三代rMSC進行表型等鑒定。將重組腺病毒感染rMSC并同時做好對照組。細胞分組如下：實驗組使用含rIL-10重組腺病毒(Ad.IL-10)感染rMSC(loadedrMSC/rIL-10+)；對照組使用不含rIL-10的重組腺病毒(Ad.GFP)感染rMSC(loadedrMSC/rIL-10-)。用不同的感染倍數(shù)(multipleofinfection，m.o.i)的Ad.rIL-1

7、0/Ad.GFP感染rMSC，在熒光顯微鏡下觀察感染效率，并用ELISA、RT-PCR和Weaternblot方法檢測外源基因rIL-10在rMSC中的表達情況。 結果1采用RT-PCR方法從健康SD大鼠新鮮脾臟組織中提取的總RNA中成功地克隆出rIL-10基因，構建了重組腺病毒Ad.rIL-10，Westernblotting和RT-PCR證實構建成功。大規(guī)模擴增并濃縮后，計算病毒滴度為6.0×1010pfu/mL。

8、2采用密度梯度離心法結合貼壁法原代培養(yǎng)并于體外擴增出rMSCs，高表達CD29，CD105和CD166，不表達CD45。 3重組腺病毒Ad.rIL-10對骨髓間充質干細胞有較高的轉染效率，當MOI200時為70％。用ELISA的方法檢測上清中rIL-10的含量高達(136.2±15.62)ng/mL并維持于較高水平兩周以上。 4重組腺病毒感染的rMSC可持續(xù)高效表達外源基因rIL-10。rIL-10可通過細胞因子網(wǎng)絡而發(fā)

9、揮其生物學作用。 結論1采用RT-PCR方法從健康SD大鼠新鮮脾臟組織中提取出的總RNA中克隆rIL-10基因，構建出重組腺病毒Ad.rIL-10。經(jīng)擴增純化獲得病毒滴度為6.0×1010pfu/mL足以進行后續(xù)實驗。 2聯(lián)合使用密度梯度離心法和貼壁法進行原代培養(yǎng)并于體外擴增出rMSCs，高表達CD29，CD105和CD166，不表達CD45。方法簡便易行，穩(wěn)定可靠，產(chǎn)量和質量均能夠滿足實驗的需要。 3重組腺病毒