人呼吸道合胞病毒F蛋白非復制型重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的：人呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyncytialVirus，RSV)廣泛分布于世界各地，是導致嬰幼兒嚴重下呼吸道感染最重要的病毒病原。病毒感染機體后的免疫保護機制尚未明確，也無特異性防治方法。RSV融合糖蛋白(fusionglycoprotein，F(xiàn))和吸附蛋白(attachmentglycoprotein，G)是RSV僅有的兩種中和抗原。RSV只有一種血清型，主要由于G蛋白抗原性的差異，可進一步分為A和B兩種

2、抗原亞型。F蛋白在RSV不同亞型間具有高度的抗原同源性，是主要的交叉保護性抗原。本研究擬克隆RSVF基因，采用非復制型腺病毒載體，利用同源重組方法，構(gòu)建含有F基因的非復制型腺病毒重組體，獲得一株可表達RSVF的非復制型重組腺病毒FGAd/HRSVF，用于體內(nèi)免疫效果及免疫保護作用的研究。 方法：本文根據(jù)F基因堿基序列，設計并合成引物，以F基因逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，采用高保真DNA聚合酶，PCR擴增，得到F基因編碼序列。然后克

3、隆到pGEM-3zf載體中，序列測定正確后，將其亞克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)上，酶切鑒定，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS-7細胞，應用Westernblot方法分析F基因表達情況。將F基因亞克隆于腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV，PmeⅠ線性化重組穿梭載體，與腺病毒骨架載體pAdEasy-1在E.coliBJ5183細胞內(nèi)同源重組得到重組腺病毒DNA質(zhì)粒。以PacⅠ酶切獲得的重組腺病毒DNA分子，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細胞，產(chǎn)生基因

4、組結(jié)構(gòu)均一的重組腺病毒。Westernblot鑒定目的基因表達。 結(jié)果：采用RT-PCR法擴增獲得F蛋白基因編碼序列。核酸序列分析顯示沒有發(fā)生無義突變。轉(zhuǎn)染COS-7細胞后，利用Westernblot方法檢測到了F蛋白的特異性條帶。進一步克隆至腺病毒穿梭載體pShuttleCMV，在E.coliBJ5183內(nèi)和腺病毒骨架載體pAdeasy-1實現(xiàn)同源重組，獲得克隆有RSVF的重組腺病毒質(zhì)粒pFGAd/HRSVF，經(jīng)PacⅠ線性化