可表達人呼吸道合胞病毒融合蛋白的輔助病毒依賴型腺病毒載體的構(gòu)建與制備.pdf

1、目的:人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，RSV)廣泛流行于世界各地，是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原。目前尚無安全、有效的疫苗用于預防RSV感染。RSV兩個重要的糖蛋白膜表面表達的融合蛋白F(fusion protein，F(xiàn))和粘附蛋白G，是激發(fā)機體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白，也是疫苗研究發(fā)展的重要內(nèi)容。與G蛋白相比，F(xiàn)蛋白有更多的抗原識別位點，不同亞型間F蛋白高度保守、同源性高達86％，

2、能刺激機體產(chǎn)生體液免疫及細胞免疫應答，針對F的中和抗體具有交叉保護作用，是RSV疫苗研究的最重要的靶抗原。輔助病毒依賴型腺病毒載體(helper-dependent adenoviral vector，HDAd)主要用于基因治療研究，作為疫苗載體的研究起步較晚，尚沒有作為黏膜基因釋放系統(tǒng)用于疫苗研究的報道。HDAd與腺病毒具有相同的細胞嗜性，對呼吸道上皮細胞具有高效感染的能力，且能長期、持續(xù)表達轉(zhuǎn)基因，具有重要的研究與使用價值。本研究擬

3、構(gòu)建可表達A亞型RSv F蛋白的輔助病毒依賴型腺病毒載體(HDAd/F)，并完成大量制備、純化和F蛋白的體外表達鑒定，為進一步的體內(nèi)免疫效果和免疫保護作用研究奠定基礎(chǔ)。 方法:將帶有CMV啟動子序列的F基因亞克隆至克隆載體pSC11，鑒定正確后，克隆至HDAd質(zhì)粒-pSC15B，構(gòu)建pSC15B/F HDAd重組質(zhì)粒，Pme Ⅰ消化pSC15B/F去除原核復制元件及抗性基因，獲得 HDAd/F DNA分子，經(jīng)磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染2

4、93Cre4細胞，16 h后感染輔助病毒，收獲 HDAd/F 載體粗提液，隨后以 HDAd/F粗提液及輔助病毒連續(xù)共感染293Cre4細胞直至HDAd/F達到復制極限，同時以可表達β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，LacZ)報告基因的HDAdLacZ載體作為平行對照監(jiān)測載體復制過程。大量制備 HDAd/F，CsCl密度梯度及等密度梯度兩次超速離心純化，利用分子生物學技術(shù)體外鑒定HDAd/F表達情況。 結(jié)果:成功構(gòu)建

5、了可表達 RSV F 蛋白的 HDAd/F 載體，通過與輔助病毒共感染293Cre4細胞及CsCl梯度法超速離心制備了大量純化的HDAd/F載體，透射電鏡觀察顯示HDAd的直徑約為70 nm，具有典型的腺病毒形態(tài)，運用分光光度測定法分析表明純化后HDAd載體顆粒濃度為：7.4×10<'12>(vp/ml)，體外感染293細胞，RT-PCR檢測到F基因有轉(zhuǎn)錄，Western blot分析表明F蛋白有特異性表達。 結(jié)論:成功構(gòu)建HD