人呼吸道合胞病毒G蛋白非復(fù)制型腺病毒重組體的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、目的：人呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyncytialVirus，RSV)廣泛分布于世界各地，是導(dǎo)致嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。目前尚無特異性防治方法，世界衛(wèi)生組織將發(fā)展RSV疫苗列為最優(yōu)先發(fā)展的疫苗項目之一。RSV的11種蛋白中，包膜黏附糖蛋白(attachmentglycoprotein，G)是中和抗原，免疫動物后，可以產(chǎn)生具有免疫保護(hù)作用的中和抗體，為新型疫苗候選抗原。本文利用同源重組方法，獲得表

2、達(dá)G蛋白的非復(fù)制型腺病毒重組體，為體內(nèi)免疫效果和免疫保護(hù)作用研究奠定基礎(chǔ)。 方法：本研究依據(jù)GenBank收錄的A亞型RSVLong株堿基序列(收錄號為M17212)，設(shè)計并合成一對特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)，從感染RSV的HEp-2細(xì)胞中獲得G基因片段，克隆到pGEM-Teasy載體。經(jīng)核酸序列分析正確后，進(jìn)一步亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，得到重組載體pcDNA3.1(+)G，酶切鑒定后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CO

3、S-7細(xì)胞，RT-PCR和Westernblotting鑒定基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。限制性內(nèi)切酶從pcDNA3.1(+)G中切下目的基因G，亞克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV，獲得重組穿梭質(zhì)粒pSCG。酶切鑒定后，PmeⅠ線性化pSCG，利用電穿孔法轉(zhuǎn)化技術(shù)，把線性pSCG轉(zhuǎn)入含有pAdeasy-1的大腸桿菌E.coliBJ5183/p中進(jìn)行同源重組，獲得重組腺病毒質(zhì)粒pFGAd/RSVG。酶切鑒定后，以PacⅠ酶切pFGAd/

4、RSVG，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞.。待出現(xiàn)典型的致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect，CPE)后，取細(xì)胞裂解液，以Westernblotting鑒定目的基因表達(dá)。 結(jié)果：重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)G的限制性內(nèi)切酶分析結(jié)果與預(yù)期一致，基因序列分析顯示RSVG基因沒有發(fā)生無義突變。轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，RT-PCR檢測到G基因有轉(zhuǎn)錄，Westernblotting分析觀察到G蛋白特異性的表達(dá)條帶。重組穿梭質(zhì)粒pS