攜帶白介素24基因的雙靶向溶瘤腺病毒特異性治療胰腺癌的實驗研究.pdf

1、胰腺導(dǎo)管腺癌惡性程度高，缺乏早期診斷手段，多數(shù)患者確診時無法切除，即便是根治性切除，五年生存率亦不足20％。而傳統(tǒng)的放化療對胰腺癌作用有限，目前眾多的新一代研究均關(guān)注于如何改善胰腺癌的預(yù)后。
　　本課題，我們構(gòu)建了一種攜帶白介素24(IL-24)基因的雙靶向溶瘤腺病毒（MUD55-IL-24），借以用于胰腺癌的實驗研究。我們首先刪除腺病毒在正常細胞內(nèi)復(fù)制必需，而在腫瘤細胞中復(fù)制非必需的E1B-55K基因，使其能特異性的在腫瘤細胞內(nèi)

2、復(fù)制擴增。此外，我們注意到多數(shù)胰腺導(dǎo)管腺癌高表達MUC1，而正常胰腺組織不表達或低表達，這一現(xiàn)象提示MUC1基因轉(zhuǎn)錄啟動子活性在胰腺導(dǎo)管腺癌細胞中活性較高，利用胰腺癌細胞的這一特性，采用基因重組方法，以MUC1啟動子代替腺病毒復(fù)制早期蛋白E1A基因的啟動子，從而我們構(gòu)建了這種能特異性地在胰腺導(dǎo)管腺癌細胞中復(fù)制增殖，溶解腫瘤細胞，而在正常細胞中復(fù)制能力較弱，毒副作用較小的病毒。為了增強這種雙靶向溶瘤腺病毒的殺傷作用，我們將IL-24基因插

3、入腺病毒基因組中構(gòu)建病毒MUD55-IL-24，隨著病毒的復(fù)制，IL-24也隨之大量表達，從而發(fā)揮IL-24強大的抗腫瘤效應(yīng)。本課題主要經(jīng)過以下幾方面研究:(1)構(gòu)建、包裝雙調(diào)控溶瘤腺病毒及攜帶IL-24基因的雙調(diào)控腺病毒并對其進行鑒定;(2)基因-病毒MUD55-IL-24體外特異性殺傷胰腺癌細胞能力研究;(3) MUD55的體內(nèi)安全性和MUD55-IL-24的抑制皮下移植腫瘤能力的研究。
　　第一部分基因-病毒MUD55-IL

4、-24的構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建并包裝雙靶向溶瘤腺病毒及攜帶IL-24基因的雙調(diào)控腺病毒
　　方法:使用TRIzol抽提多種腺癌細胞、非腺癌腫瘤細胞及正常細胞的RNA，以通用的反轉(zhuǎn)錄引物將所有的mRNA反轉(zhuǎn)錄成eDNA，使用實時定量PCR試劑盒Realtime Master Mix對不同細胞內(nèi)的MUC1水平進行定量，并以GAPDH作為內(nèi)參，實行相對定量。以質(zhì)粒pDRIVE03-DF3(h)v2為模板，PCR擴增出MUC1啟

5、動子，將其克隆進pGL3-basic形成報告基因質(zhì)粒pGL3-MUC1p。將質(zhì)粒pGL3-MUC1p和內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入各種細胞系檢測MUC1啟動子的啟動活性。同樣以質(zhì)粒為模板，PCR擴增出MUC1啟動子，將它克隆入已經(jīng)刪除E1A啟動子的質(zhì)粒pZX2中，再將形成的質(zhì)粒和pZD55均進行酶切后大小片段連接，構(gòu)建雙調(diào)控的小質(zhì)粒pMUD55。從pZD55-IL-24上酶切下IL-24的基因表達框接入pMUD55中以構(gòu)建pMUD55-IL-24。

6、將構(gòu)建產(chǎn)生的小質(zhì)粒與pBHGE3共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，同源重組產(chǎn)生相應(yīng)的病毒。鋪膠挑空斑后擴增鑒定病毒，選取正確且無其他病毒污染的病毒進行大量擴增，在使用氯化銫梯度密度離心獲得純化的腺病毒，對病毒進行滴度測定。用病毒感染腫瘤細胞，在一定的時間收取細胞的蛋白，western檢測病毒的蛋白的表達情況。
　　結(jié)果:通過實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，幾種腺癌細胞中的MUC1的mRNA水平均較高，而正常細胞和非腺癌的腫瘤細胞中水平較低。對克隆產(chǎn)

7、生的報告基因質(zhì)粒pGL3-MUC1p進行測序，并與數(shù)據(jù)庫中MUC1啟動子序列進行比對，MUC1啟動子序列正確。將構(gòu)建好的質(zhì)粒pGL3-MUC1p轉(zhuǎn)染不同細胞系后檢測MUC1啟動子活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MUC1特異性在腺癌細胞系中表現(xiàn)出高啟動活性，與強啟動子CMV啟動子活性接近，而在多種正常細胞系和多種非腺癌腫瘤細胞系中，MUC1的啟動活性較低，不到CMV啟動活性的10％，三類細胞間MUC1基因啟動子活性差異比較具統(tǒng)計學(xué)意義。通過同源重組的方式獲

8、得純凈的目的病毒，對病毒大量擴增后純化，得到可以進行細胞實驗和動物實驗的病毒。測定各種病毒滴度，并根據(jù)病毒滴度計算后續(xù)加入細胞中和注射動物用病毒用量。使用病毒處理腫瘤細胞后收取蛋白檢測病毒蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，除了非復(fù)制性病毒AD-IL-24外，其他病毒均能表達E1A; MUD55、MUD55-IL-24、ZD55、AD-IL-24不能表達E1B55K蛋白，而Ad.MUC1和Ad.WT表達E1B55K蛋白，所有病毒的蛋白表達情況均與

9、預(yù)想一致，提示病毒構(gòu)建正確。
　　結(jié)論:通過同源重組的方式獲得了與預(yù)設(shè)基因組一致的雙靶向腺病毒和攜帶IL-24基因的雙靶向腺病毒
　　第二部分 MUD55-IL-24特異性殺傷胰腺癌細胞體外實驗
　　目的:檢測基因-病毒MUD55-IL-24體外特異性殺傷胰腺癌細胞的能力
　　方法:不同病毒分別感染正常細胞MRC-5和胰腺癌細胞PANC-1，分別于12 h、24 h，、36 h、48 h收集細胞蛋白，使用蛋白印跡

10、方法檢測病毒感染細胞后不同時間節(jié)點IL-24蛋白在細胞內(nèi)表達水平的變化。同時，在這4個時間點分別收取病毒處理細胞的培養(yǎng)液，使用ELISA法檢測上清中IL-24蛋白水平。用不同病毒分別處理96孔板中MRC-5細胞和PANC-1細胞，在不同時間點分別檢測細胞穩(wěn)定性。使用不同病毒處理PANC-1細胞，在48 h、72h、96h采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色方法檢測病毒處理后凋亡細胞比例。
　　結(jié)果:通過western和ELIS

11、A方法檢測發(fā)現(xiàn)在MRC-5細胞內(nèi)和上清中，MUD55-IL-24處理組IL-24表達水平與AD-IL-24處理組接近，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而在PANC-1細胞內(nèi)和上清中MUD55-IL-24介導(dǎo)的IL-24的表達顯著高于AD-IL-24組，兩者差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001); MUD55病毒在兩組細胞的細胞內(nèi)及上清液中IL-24表達極低。我們用MTT的方法檢測AD-IL-24，MUD55及MUD55-IL-24三者

12、在體外對MRC-5及PANC-1細胞株的殺傷效果，結(jié)果顯示對于MRC-5，三者均未引起顯著的細胞毒性，但在PANC-1細胞株中，MUD55-IL-24殺傷效率顯著高于其他病毒。檢測發(fā)現(xiàn)與對照病毒比較，MUD55-IL-24能顯著提高誘導(dǎo)PANC-1細胞的凋亡比率。
　　結(jié)論:基因-病毒MUD55-IL-24能特異性在胰腺癌細胞中大量表達IL-24蛋白，具有特異性殺傷胰腺癌細胞的特點。
　　第三部分雙調(diào)控病毒的體內(nèi)安全性和抑制

13、皮下移植瘤研究
　　目的:檢測雙靶向病毒MUD55的體內(nèi)安全性和基因-病毒MUD55-IL-24抑制皮下移植瘤的能力
　　方法:采用尾靜脈注射方式分別向裸鼠體內(nèi)注射病毒PBS、Ad.MUC1、ZD55、MUD55、Ad.WT，每種病毒分為低劑量和高劑量組。在病毒注射后3天取裸鼠血檢測ALT、AST水平，并比較各組之間兩者水平的差異。取病毒處理裸鼠肝臟，制備石蠟切片進行HE染色，觀察淋巴細胞浸潤等炎癥反應(yīng)。抽提裸鼠肝臟RNA，

14、反轉(zhuǎn)錄后進行定量PCR，檢測肝臟中病毒蛋白E1A的表達水平。向裸鼠皮下注射PANC-1細胞形成移植瘤，待移植瘤達到一定大小后，瘤內(nèi)注射PBS、AD-IL-24、MUD55、MUD55-IL-24，注射結(jié)束后測量腫瘤體積，每周測量兩次，繪制不同病毒處理組裸鼠皮下移植瘤的生長曲線。同時每周測量兩次裸鼠體重，觀察病毒對裸鼠狀態(tài)的影響。在腫瘤生長實驗結(jié)束后處死裸鼠，將腫瘤取下稱重并制備成石蠟切片，檢測腫瘤組織中IL-24蛋白、hexon蛋白的表

15、達水平，采用TUNEL法檢測病毒引起的腫瘤凋亡情況。
　　結(jié)果:尾靜脈注射裸鼠實驗發(fā)現(xiàn)，野生型腺病毒Ad.WT和單靶向腺病毒ZD55、Ad.MUC1可以引起裸鼠血清中的ALT及AST水平顯著上升，誘發(fā)淋巴細胞浸潤肝臟，具有一定的肝臟毒性;而雙靶向病毒MUD55則幾乎不影響血清ALT、AST水平，淋巴細胞浸潤現(xiàn)象也不明顯。肝臟中E1A mRNA水平檢測顯示，MUD55處理組裸鼠肝臟中的E1A水平明顯低于其他三組，組間差異比較具統(tǒng)計學(xué)

16、意義(P＜0.05)，這說明MUD55在裸鼠肝臟中的復(fù)制能力最弱。在PANC-1細胞株裸鼠皮下移植瘤動物模型中，腫瘤體積及腫瘤重量測量均顯示MUD55-IL-24抑制腫瘤能力顯著優(yōu)于AD-IL-24及MUD55(P＜0.05)。腫瘤組織切片TUNEL染色結(jié)果顯示MUD55-IL-24比非復(fù)制病毒組和單純病毒組TUNEL陽性細胞更多。
　　結(jié)論:雙靶向病毒MUD55具有較好的體內(nèi)安全性，基因-病毒MUD55-IL-24能有效的抑制裸