攜帶白介素24基因的雙靶向溶瘤腺病毒特異性治療胰腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胰腺導(dǎo)管腺癌惡性程度高，缺乏早期診斷手段，多數(shù)患者確診時(shí)無(wú)法切除，即便是根治性切除，五年生存率亦不足20％。而傳統(tǒng)的放化療對(duì)胰腺癌作用有限，目前眾多的新一代研究均關(guān)注于如何改善胰腺癌的預(yù)后。
　　本課題，我們構(gòu)建了一種攜帶白介素24(IL-24)基因的雙靶向溶瘤腺病毒（MUD55-IL-24），借以用于胰腺癌的實(shí)驗(yàn)研究。我們首先刪除腺病毒在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制必需，而在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制非必需的E1B-55K基因，使其能特異性的在腫瘤細(xì)胞內(nèi)

2、復(fù)制擴(kuò)增。此外，我們注意到多數(shù)胰腺導(dǎo)管腺癌高表達(dá)MUC1，而正常胰腺組織不表達(dá)或低表達(dá)，這一現(xiàn)象提示MUC1基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中活性較高，利用胰腺癌細(xì)胞的這一特性，采用基因重組方法，以MUC1啟動(dòng)子代替腺病毒復(fù)制早期蛋白E1A基因的啟動(dòng)子，從而我們構(gòu)建了這種能特異性地在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中復(fù)制增殖，溶解腫瘤細(xì)胞，而在正常細(xì)胞中復(fù)制能力較弱，毒副作用較小的病毒。為了增強(qiáng)這種雙靶向溶瘤腺病毒的殺傷作用，我們將IL-24基因插

3、入腺病毒基因組中構(gòu)建病毒MUD55-IL-24，隨著病毒的復(fù)制，IL-24也隨之大量表達(dá)，從而發(fā)揮IL-24強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)。本課題主要經(jīng)過以下幾方面研究:(1)構(gòu)建、包裝雙調(diào)控溶瘤腺病毒及攜帶IL-24基因的雙調(diào)控腺病毒并對(duì)其進(jìn)行鑒定;(2)基因-病毒MUD55-IL-24體外特異性殺傷胰腺癌細(xì)胞能力研究;(3) MUD55的體內(nèi)安全性和MUD55-IL-24的抑制皮下移植腫瘤能力的研究。
　　第一部分基因-病毒MUD55-IL

4、-24的構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建并包裝雙靶向溶瘤腺病毒及攜帶IL-24基因的雙調(diào)控腺病毒
　　方法:使用TRIzol抽提多種腺癌細(xì)胞、非腺癌腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的RNA，以通用的反轉(zhuǎn)錄引物將所有的mRNA反轉(zhuǎn)錄成eDNA，使用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒Realtime Master Mix對(duì)不同細(xì)胞內(nèi)的MUC1水平進(jìn)行定量，并以GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)行相對(duì)定量。以質(zhì)粒pDRIVE03-DF3(h)v2為模板，PCR擴(kuò)增出MUC1啟

5、動(dòng)子，將其克隆進(jìn)pGL3-basic形成報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-MUC1p。將質(zhì)粒pGL3-MUC1p和內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入各種細(xì)胞系檢測(cè)MUC1啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性。同樣以質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出MUC1啟動(dòng)子，將它克隆入已經(jīng)刪除E1A啟動(dòng)子的質(zhì)粒pZX2中，再將形成的質(zhì)粒和pZD55均進(jìn)行酶切后大小片段連接，構(gòu)建雙調(diào)控的小質(zhì)粒pMUD55。從pZD55-IL-24上酶切下IL-24的基因表達(dá)框接入pMUD55中以構(gòu)建pMUD55-IL-24。

6、將構(gòu)建產(chǎn)生的小質(zhì)粒與pBHGE3共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，同源重組產(chǎn)生相應(yīng)的病毒。鋪膠挑空斑后擴(kuò)增鑒定病毒，選取正確且無(wú)其他病毒污染的病毒進(jìn)行大量擴(kuò)增，在使用氯化銫梯度密度離心獲得純化的腺病毒，對(duì)病毒進(jìn)行滴度測(cè)定。用病毒感染腫瘤細(xì)胞，在一定的時(shí)間收取細(xì)胞的蛋白，western檢測(cè)病毒的蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，幾種腺癌細(xì)胞中的MUC1的mRNA水平均較高，而正常細(xì)胞和非腺癌的腫瘤細(xì)胞中水平較低。對(duì)克隆產(chǎn)

7、生的報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-MUC1p進(jìn)行測(cè)序，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中MUC1啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)，MUC1啟動(dòng)子序列正確。將構(gòu)建好的質(zhì)粒pGL3-MUC1p轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞系后檢測(cè)MUC1啟動(dòng)子活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MUC1特異性在腺癌細(xì)胞系中表現(xiàn)出高啟動(dòng)活性，與強(qiáng)啟動(dòng)子CMV啟動(dòng)子活性接近，而在多種正常細(xì)胞系和多種非腺癌腫瘤細(xì)胞系中，MUC1的啟動(dòng)活性較低，不到CMV啟動(dòng)活性的10％，三類細(xì)胞間MUC1基因啟動(dòng)子活性差異比較具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過同源重組的方式獲

8、得純凈的目的病毒，對(duì)病毒大量擴(kuò)增后純化，得到可以進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的病毒。測(cè)定各種病毒滴度，并根據(jù)病毒滴度計(jì)算后續(xù)加入細(xì)胞中和注射動(dòng)物用病毒用量。使用病毒處理腫瘤細(xì)胞后收取蛋白檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，除了非復(fù)制性病毒AD-IL-24外，其他病毒均能表達(dá)E1A; MUD55、MUD55-IL-24、ZD55、AD-IL-24不能表達(dá)E1B55K蛋白，而Ad.MUC1和Ad.WT表達(dá)E1B55K蛋白，所有病毒的蛋白表達(dá)情況均與

9、預(yù)想一致，提示病毒構(gòu)建正確。
　　結(jié)論:通過同源重組的方式獲得了與預(yù)設(shè)基因組一致的雙靶向腺病毒和攜帶IL-24基因的雙靶向腺病毒
　　第二部分 MUD55-IL-24特異性殺傷胰腺癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)
　　目的:檢測(cè)基因-病毒MUD55-IL-24體外特異性殺傷胰腺癌細(xì)胞的能力
　　方法:不同病毒分別感染正常細(xì)胞MRC-5和胰腺癌細(xì)胞PANC-1，分別于12 h、24 h，、36 h、48 h收集細(xì)胞蛋白，使用蛋白印跡

10、方法檢測(cè)病毒感染細(xì)胞后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)IL-24蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的變化。同時(shí)，在這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別收取病毒處理細(xì)胞的培養(yǎng)液，使用ELISA法檢測(cè)上清中IL-24蛋白水平。用不同病毒分別處理96孔板中MRC-5細(xì)胞和PANC-1細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)細(xì)胞穩(wěn)定性。使用不同病毒處理PANC-1細(xì)胞，在48 h、72h、96h采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色方法檢測(cè)病毒處理后凋亡細(xì)胞比例。
　　結(jié)果:通過western和ELIS

11、A方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在MRC-5細(xì)胞內(nèi)和上清中，MUD55-IL-24處理組IL-24表達(dá)水平與AD-IL-24處理組接近，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而在PANC-1細(xì)胞內(nèi)和上清中MUD55-IL-24介導(dǎo)的IL-24的表達(dá)顯著高于AD-IL-24組，兩者差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001); MUD55病毒在兩組細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)及上清液中IL-24表達(dá)極低。我們用MTT的方法檢測(cè)AD-IL-24，MUD55及MUD55-IL-24三者

12、在體外對(duì)MRC-5及PANC-1細(xì)胞株的殺傷效果，結(jié)果顯示對(duì)于MRC-5，三者均未引起顯著的細(xì)胞毒性，但在PANC-1細(xì)胞株中，MUD55-IL-24殺傷效率顯著高于其他病毒。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照病毒比較，MUD55-IL-24能顯著提高誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞的凋亡比率。
　　結(jié)論:基因-病毒MUD55-IL-24能特異性在胰腺癌細(xì)胞中大量表達(dá)IL-24蛋白，具有特異性殺傷胰腺癌細(xì)胞的特點(diǎn)。
　　第三部分雙調(diào)控病毒的體內(nèi)安全性和抑制

13、皮下移植瘤研究
　　目的:檢測(cè)雙靶向病毒MUD55的體內(nèi)安全性和基因-病毒MUD55-IL-24抑制皮下移植瘤的能力
　　方法:采用尾靜脈注射方式分別向裸鼠體內(nèi)注射病毒PBS、Ad.MUC1、ZD55、MUD55、Ad.WT，每種病毒分為低劑量和高劑量組。在病毒注射后3天取裸鼠血檢測(cè)ALT、AST水平，并比較各組之間兩者水平的差異。取病毒處理裸鼠肝臟，制備石蠟切片進(jìn)行HE染色，觀察淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥反應(yīng)。抽提裸鼠肝臟RNA，

14、反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量PCR，檢測(cè)肝臟中病毒蛋白E1A的表達(dá)水平。向裸鼠皮下注射PANC-1細(xì)胞形成移植瘤，待移植瘤達(dá)到一定大小后，瘤內(nèi)注射PBS、AD-IL-24、MUD55、MUD55-IL-24，注射結(jié)束后測(cè)量腫瘤體積，每周測(cè)量?jī)纱危L制不同病毒處理組裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)曲線。同時(shí)每周測(cè)量?jī)纱温闶篌w重，觀察病毒對(duì)裸鼠狀態(tài)的影響。在腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死裸鼠，將腫瘤取下稱重并制備成石蠟切片，檢測(cè)腫瘤組織中IL-24蛋白、hexon蛋白的表

15、達(dá)水平，采用TUNEL法檢測(cè)病毒引起的腫瘤凋亡情況。
　　結(jié)果:尾靜脈注射裸鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生型腺病毒Ad.WT和單靶向腺病毒ZD55、Ad.MUC1可以引起裸鼠血清中的ALT及AST水平顯著上升，誘發(fā)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)肝臟，具有一定的肝臟毒性;而雙靶向病毒MUD55則幾乎不影響血清ALT、AST水平，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象也不明顯。肝臟中E1A mRNA水平檢測(cè)顯示，MUD55處理組裸鼠肝臟中的E1A水平明顯低于其他三組，組間差異比較具統(tǒng)計(jì)學(xué)

16、意義(P＜0.05)，這說明MUD55在裸鼠肝臟中的復(fù)制能力最弱。在PANC-1細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型中，腫瘤體積及腫瘤重量測(cè)量均顯示MUD55-IL-24抑制腫瘤能力顯著優(yōu)于AD-IL-24及MUD55(P＜0.05)。腫瘤組織切片TUNEL染色結(jié)果顯示MUD55-IL-24比非復(fù)制病毒組和單純病毒組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞更多。
　　結(jié)論:雙靶向病毒MUD55具有較好的體內(nèi)安全性，基因-病毒MUD55-IL-24能有效的抑制裸