2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、1. 隆人canstatin基因目的:克隆內(nèi)源性血管抑素canstatin基因,測定并分析其基因序列。方法:從人胎盤組織中提取總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)擴增canstatin基因,克隆進載體pUCm-T,獲得重組質(zhì)粒pUCm-T/canstatin,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,挑選陽性克隆,測定基因序列。 結(jié)果:從人胎盤組織中提取出總RNA,10g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示3條清晰條帶,分別對應(yīng)28S,18S,

2、5S。分光光度計測定總RNA的A260=0.879,A280=0.410,A260/A200=2.095,總RNA濃度為1.8g/L。RT-PCR擴增產(chǎn)物與預(yù)期的目的基因canstatin長度一致。RT-PCR產(chǎn)物與載體pUCm-T連接過夜后,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,在含氨芐青霉素的LB平板上生長出藍色和白色菌落。挑選6個白色菌落做酶切鑒定,其中一個菌落經(jīng)BamHI和HindⅢ酶切后,證實為陽性克隆。測定該陽性克隆基因序列,結(jié)果顯示其

3、與GenBank公布的canstatin基因序列完全一致。結(jié)論:成功克隆了canstatin基因,為進一步研究其抗腫瘤作用打下基礎(chǔ)。 2. 核表達并純化重組人Canstatin蛋白目的:構(gòu)建canstatin原核表達載體,表達并純化出重組人Canstatin蛋白。方法:利用BamHI和HindⅢ從重組質(zhì)粒pUCm-T/canstatin上切下canstatin基因,插入表達質(zhì)粒pET-22b(+)相應(yīng)位點,轉(zhuǎn)化E.coliBL2

4、1。IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達,SDS-PAGE電泳分析蛋白表達情況。超聲破碎菌體,Ni-NTA柱親和層析純化重組蛋白,PBS對其透析復(fù)性。 結(jié)論:成功構(gòu)建了canstatin原核表達載體,表達并純化出重組人Canstatin蛋白,為進一步研究其抗腫瘤作用打下基礎(chǔ)。 3. 組人Canstatin蛋白治療胰腺癌的體內(nèi)實驗研究目的:驗證重組人Canstatin蛋白體內(nèi)對胰腺癌的治療作用。方法:利用胰腺癌SW19~細胞株建立裸鼠

5、胰腺癌皮下和原位移植瘤模型。32只皮下移植瘤的裸鼠,當(dāng)腫瘤長至2-3mm時,隨機分4組,即PBS(0.3ml1/日)對照組、5-Fu(25mg/kg,1/日×5天)治療組、Canstatin(5mg/kg,1/日×3周)治療組、及5-Fu(12.5mg/kg1/日×5天)+Canstatin(5mg/kg,1/日×3周)聯(lián)合治療組,給藥途徑為腹腔注射。24只原位移植瘤的裸鼠,手術(shù)后1周,隨機分為PBS(0.3ml,1/日)對照組、小劑量

6、Canstatin(5mg/kg,1/日)治療組和較大劑量Canstatin(10mg/kg,1/日)治療組,共3組,給藥途徑亦為腹腔注射,療程3周。治療期間,定期用圓規(guī)和游標卡尺測量皮下移植瘤大小。療程結(jié)束時,取下瘤體,常規(guī)病理切片,CD34免疫組化染色,檢測腫瘤新生血管生成情況。結(jié)果:對裸鼠皮下移植瘤的治療結(jié)果表明,治療后第3天開始,Canstatin治療組移植瘤體積顯著小于對照組(P<0.05),到第10天時,有非常顯著差異(P<

7、0.01),療程結(jié)束時,抑瘤率為65.79%;聯(lián)合應(yīng)用5-Fu能增強療效,療程結(jié)束時,抑瘤率達82.20%;雖然5-Fu治療組療效最顯著,抑瘤率達94.74%,但藥物毒性反應(yīng)明顯,接受治療小鼠惡液質(zhì)明顯,病理證實有嚴重的肝損害。對裸鼠原位移植瘤的治療結(jié)果表明,小劑量和較大劑量Canstatin蛋白治療組,移植瘤體積和重量均顯著低于對照組,移植瘤體積分別為112.73±10.47mm3、61.75±6.99mm3、355.21±39.54

8、mm3。無論皮下還是原位移植瘤,接受Canstatin治療的腫瘤組織內(nèi)MVD均顯著低于對照組,而5-Fu單獨治療組,腫瘤內(nèi)MVD與對照組間無顯著差異。 結(jié)論:重組人Canstatin蛋白能有效抑制人胰腺癌生長,抑瘤作用與劑量呈正相關(guān),作用機制是抑制腫瘤新血管形成,沒有明顯副作用。與細胞毒藥物聯(lián)合使用,能增強抗腫瘤療效。 4. 帶canstatin基因的增殖型腺病毒載體He-Cans的構(gòu)建目的:將抗血管生成治療和基因治療相

9、結(jié)合,構(gòu)建攜帶canstatin基因的腫瘤特異性增殖型腺病毒He-Cans。 方法:利用PCR技術(shù),擴增pET/canstatin載體上canstatin目的基因,EcoRI+BamHI酶切后,插入pCA13相應(yīng)位點,構(gòu)建成pCA13-Cans;利用BglⅡ酶切位于pCA13-Cans上canstatin基因表達盒,插入穿梭載體pXC7C相應(yīng)位點,構(gòu)建成pXC7C-Cans載體。pCA13-Cans和pXC7C-Cans分別與p

10、BGHE3共轉(zhuǎn)染293細胞,3次病毒空斑純化后,利用PCR技術(shù)對重組病毒進行鑒定。最后,經(jīng)293細胞擴增、氯化銫密度梯度離心純化后,TCID50檢測重組病毒滴度。 結(jié)論:獲得了高滴度重組非增殖腺病毒Ad5-Cans和增殖型腺病毒He-Cans,為研究其抗腫瘤作用奠定基礎(chǔ)。 5. 殖型腺病毒He-Cans生物學(xué)特性體外實驗研究目的:研究增殖型腺病毒He-Cans體外生物學(xué)特性。方法:通過WesternBlot方法檢測重組腺

11、病毒He-Cans抗血管生成蛋白Canstatin表達情況,通過病毒增殖實驗比較He-Cans在腫瘤細胞和正常細胞中增殖差異,通過細胞殺傷實驗(MT實驗),檢測He-Cans對胰腺癌細胞的殺傷能力。 結(jié)果:WesternBlot證實重組腺病毒Ad5-Cans及He-Cans感染胰腺癌BXPC-3細胞后能有效表達Canstatin蛋白;He-Cans在胰腺癌細胞株BXPC-3、PANC-1、AsPC-1中能有效增殖,而在人正常肝細

12、胞(LO2)中基本不增殖,在胰腺癌細胞中的增殖倍數(shù)是正常肝細胞的20倍以上。MTT結(jié)果顯示,增殖型病毒He-Cans對胰腺癌細胞有明顯的殺傷力,在MOI值為10時,致使3種胰腺癌細胞的死亡率均>80%,而同樣MOI值,正常肝細胞死亡率僅24%。在MOI值為10時,Ad5-Cans處理的胰腺癌細胞與正常細胞存活率無顯著差異,均超過70%。 結(jié)論:Ad5-Cans和He-Cans在胰腺癌細胞中能有效的表達Canstatin抗血管生成

13、蛋白;其中He-Cans能特異性在腫瘤細胞(胰腺癌細胞)中增殖,并產(chǎn)生顯著的殺傷效應(yīng),而在正常細胞中基本不增殖,殺傷力也弱。 6. 殖型腺病毒He-Cans治療人胰腺癌體內(nèi)實驗研究目的:驗證增殖型腺病毒He-Cans體內(nèi)抗腫瘤療效。 方法:以BXPC-3人胰腺癌細胞建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型。待腫瘤生長至6-8mm,將30只荷瘤鼠隨機分為5組,即A組(PBS100μl)、B組(Canstatin蛋白5mg/kg)、C

14、組(Ad5-LacZ2×108pfu)、D組(Ad5-Cans2×108pfu)及E組(He-Cans2×108pfu),給藥途徑為瘤內(nèi)注射,重組蛋白隔日注射1次,共注射10次,其余各組藥物隔日注射1次,共注射5次。定期用圓規(guī)和游標卡尺測量腫瘤大小,療程結(jié)束時,取下瘤組織,CD34免疫組化染色,觀察腫瘤內(nèi)MVD變化。結(jié)果:療程結(jié)束時,A-E組腫瘤體積分別為2351.84±181.14mm3、1226.55±108.12mm3、2215.

15、93±149.77mm3、1452.79±226.20mm3、698.51±86.49mm3,B、D、E組腫瘤體積明顯小于A組和C組,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗,有非常顯著差異(P<0.01);而E組腫瘤體積顯著小于B組和D組,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗,亦有非常顯著差異(P<0.01)。免疫組化結(jié)果表明,與A組相比較,B、D、E組腫瘤內(nèi)MVD明顯減少,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗,D組有顯著性差異(P<0.05),B組和E組有非常顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論:重組

16、增殖型腺病毒He-Cans能有效抑制胰腺癌生長,療效強于Canstatin蛋白和非增殖腺病毒Ad5-Cans,具有給藥方便、副作用小的優(yōu)點,為進一步開發(fā)其臨床應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。 通過上述研究,本課題得出以下結(jié)論:1.成功克隆了人canstatin基因;2.成功構(gòu)建了canstatin原核表達載體;3.獲得了純化的重組人Canstatin蛋白,體內(nèi)實驗證實其能通過阻礙新生血管生成有效抑制人胰腺癌生長,具有副作用少的突出優(yōu)點;

17、 4.成功構(gòu)建了攜帶canstatin基因的非增殖型腺病毒Ad5-Cans和增殖型腺病毒He-Cans; 5.非增殖型腺病毒Ad5-Cans能有效抑制裸鼠胰腺癌生長,其作用是通過表達Canstatin蛋白抑制新生血管形成實現(xiàn)的。 6.增殖型腺病毒He-Cans能強力抑制裸鼠胰腺癌生長,療效顯著強于Ad5-Cans和Canstatin蛋白,其作用機制是:一方面表達Canstatin蛋白從而抑制腫瘤新生血管形成,另一方面

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