溶瘤腺病毒介導雙miRNAs表達對胰腺癌靶向治療的研究.pdf

1、目的：
　　胰腺癌惡性程度高，發(fā)病率逐年上升，死亡率居高不下，尚無特別有效的治療方法。盡管近年來在醫(yī)學影像學、新放化療技術、免疫治療等方面均取得了長足的進步，胰腺癌5年生存率依然低于5％。不斷有研究指出，在胰腺導管腺癌(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma，PDAC)組織中microRNA(miRNA)的表達譜發(fā)生顯著改變，調控相應靶基因的表達，在腫瘤的起始、進展等過程中發(fā)揮重要的作用，具有癌基因或抑癌

2、基因樣作用，可以調控腫瘤細胞周期、DNA損傷修復、細胞凋亡、腫瘤轉移等多種生物學行為。目前，有研究通過質?；虿《緮y帶miRNA從而改變其在胰腺癌細胞中的表達，起到治療腫瘤的作用。例如，有研究指出miR-34a和miR-let7在胰腺癌細胞中低表達，具有抑癌基因樣作用。利用納米粒子和CC9肽能夠成功將具有抑癌作用的miR-34a轉入PDAC細胞，從而抑制胰腺癌動物皮下移植瘤的生長。Torrisani等人則通過質?；蚵《緮y帶miRNA從而

3、提高miR-let7的表達，實現抑制PDAC細胞增殖的目的。盡管如此，針對單一miRNA的干預治療對胰腺癌細胞生物學特性的抑制效果仍然有限，因此我們設想在增殖性溶瘤腺病毒的基礎上同時克隆入具有抑癌作用的miR-34a和miR-let7，獲得同時攜帶miR-34a和miR-let7的重組腺病毒治療體系AdCEAp-miR34a-let7，在CEA啟動子調控下介導腫瘤細胞高效表達和釋放具有抑癌作用的miR-34a和miR-let7，發(fā)揮二者

4、的協同抗腫瘤作用，實現對癌細胞的靶向干預治療。
　　方法：
　　1、腺病毒載體的構建及鑒定:以攜帶CEA啟動子的Ad5F35嵌合型腺病毒為載體，分別克隆入具有抑癌作用的miR-34a和miR-let7基因序列，構建AdCEAp-miR34a-let7治療體系，以及陽性對照組AdCEAp-miR34a和AdCEAp-miRlet7，同時構建攜帶綠色熒光蛋白報告基因(EGFP)的對照腺病毒AdCEAp-EGFP和Ad5-EGFP

5、，并進行病毒基因組的鑒定。
　　2、溶瘤腺病毒特異性增殖活性的鑒定:用AdCEAp-EGFP和Ad5-EGFP感染人胰腺癌細胞系Panc-1、Capa-2、SW1990、BxPC3及人正常成纖維細胞BJ、MRC-5細胞，熒光顯微鏡下觀察計數EGFP陽性細胞比例及強度。另用AdCEAp-miR34a-let7、AdCEAp-miR34a、AdCEAp-miRlet7及Ad5-miR34a-let7感染上述細胞，經TCID50方法檢測

6、病毒滴度，Western Blotting方法檢測腺病毒Ela基因表達。
　　3、腺病毒介導miRNAs的表達:以MOI=1pfu/cell的強度感染腺病毒AdCEAp-miR34a-let7及Ad5-miR34a-let7。抽提總miRNA后經熒光實時定量RT-PCR法(qRT-PCR)檢測miR-34a和miR-let7的表達。
　　4、腺病毒介導雙miRNAs表達對胰腺癌細胞生物學行為的影響:以胰腺癌細胞系和正常成纖維

7、細胞為研究對象，以MOI=1pfu/cell強度感染AdCEAp-miR34a-let7、AdCEAp-miR34a、AdCEAp-miRlet7及Ad5-miR34a-let7，另設不加病毒的親代細胞同步培養(yǎng)作為空白對照。通過四唑鹽比色實驗（MTT法）檢測腺病毒介導雙miRNAs表達對胰腺癌細胞和正常成纖維細胞增殖活性的影響;通過Transwell實驗檢測其對胰腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響;通過流式細胞術檢測該治療體系對胰腺癌細胞系凋

8、亡能力的影響;提取細胞總蛋白后，采用Western Blotting方法檢測miR-34a和miR-let7相應靶蛋白以及信號分子的表達。
　　5、動物模型實驗:構建裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型，瘤內注射上述治療體系，觀察并記錄移植瘤生長情況，并繪制生長曲線，檢測其對胰腺癌生長的抑制能力。
　　結果：
　　1.腺病毒特異性增殖活性的鑒定:攜帶EGFP報告基因的增殖腺病毒AdCEAp-EGFP在胰腺癌Panc-1、Capa-

9、2、SW1990、BxPC3細胞中增殖明顯，而在正常成纖維細胞BJ、MRC-5細胞中無增殖。非增殖腺病毒Ad5-EGFP在所有細胞系中均不增殖。TCID50檢測結果顯示AdCEAp-miR34a-let7、AdCEAp-miR34a、AdCEAp-miRlet7在4株胰腺癌細胞系中增殖明顯，而在正常細胞系BJ和MRC-5中不增殖。Ad5-miR34a-let7在所有細胞系中均增殖不明顯。Ela基因檢測發(fā)現，AdCEAp-miR34a-l

10、et7在Panc-1、Capa-2、SW1990、BxPC3細胞中陽性表達Ela，而在BJ、MRC-5細胞中不表達。
　　2.腫瘤特異性增殖腺病毒介導miRNAs的表達:qRT-PCR檢測證實腺病毒AdCEAp-miR34a-let7介導miR-34a和miR-let7在胰腺癌細胞系中高水平表達，而在正常成纖維細胞系中則表達量極少。Ad5-miR34a-let7在所有細胞系中表達miR-34a和let-7均處于低水平。
　　

11、3.腫瘤特異性增殖腺病毒介導的雙miRNAs表達對胰腺癌細胞增殖活性有抑制作用:MTT檢測結果顯示，在胰腺癌Pane-1細胞及SW1990細胞中，AdCEAp-miR34a-let7組與陰性對照組相比，腫瘤細胞增殖活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(Panc-1細胞P＜0.001，SW1990細胞P＜0.01);AdCEAp-miR34a-let7組與AdCEAp-miRlet7組相比，細胞增殖活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（Panc-1細

12、胞P＜0.01，SW1990細胞P＜0.05）;AdCEAp-miR34a-let7組與AdCEAp-miR34a組相比，差異無統(tǒng)計學意義（兩種細胞均為P＞0.05）。
　　4.腫瘤特異性增殖腺病毒介導的雙miRNAs表達對胰腺癌細胞遷移和侵襲能力有抑制作用:Transwell實驗結果顯示，AdCEAp-miR34a-let7組相比AdCEAp-miR34a組、AdCEAp-miRlet7組、Ad5-miR34a-let7組及空白

13、對照組相比，前者胰腺癌細胞的侵襲能力及遷移能力均受到抑制。統(tǒng)計學分析結果顯示，AdCEAp-miR34a-let7組與AdCEAp-miRlet7組及陰性對照組相比，細胞的遷移和侵襲能力均顯著被抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　5.腫瘤特異性增殖腺病毒介導的雙miRNAs表達促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡:流式細胞術分析顯示，胰腺癌Panc-1細胞在感染攜帶miRNA的增殖性腺病毒后，其凋亡率均上升，其中AdCEAp-miR34

14、a-let7組與AdCEAp-miRlet7組及Ad5-miR34a-let7組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);AdCEAp-miR34a-let7組與AdCEAp-miR34a組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.054)。
　　6.腫瘤特異性增殖溶瘤腺病毒介導的雙miRNAs表達對胰腺癌細胞基因表達譜的影響:Western Blotting方法檢測結果可見AdCEAp-miR34a-let7治療組相比空白對照組，miR-3

15、4a的靶蛋白cyclins-D1、E2F1及Bcl-2表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義，而CDK4未發(fā)現顯著下降;miR-let7的靶蛋白HMGA2及CRD-BP表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義，而k-ras表達水平無顯著降低。
　　7.腫瘤特異性增殖溶瘤腺病毒介導的雙miRNAs表達對胰腺癌裸鼠移植瘤的生長有抑制作用:成功構建了裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型。其中，表達雙miRNA的AdCEAp-miR34a-let7治療組腫瘤生長速度明

16、顯低于其余各組，治療21天后，AdCEAp-miR34a-let7治療組腫瘤體積并無明顯上升，且有降低趨勢;其次是AdCEAp-miR34a和AdCEAp-miRlet7組，非增殖腺病毒雖然表達雙miRNAs，但其抗腫瘤效果不理想。
　　結論：
　　在本課題的研究中，我們利用CEA啟動子調控的腫瘤特異性增殖腺病毒載體的腫瘤特異性，攜帶兩種具有抑癌作用的miRNA，構建一種治療體系，使其特異性作用于腫瘤細胞，發(fā)揮兩種miRNA

17、的協同抗腫瘤作用。為胰腺癌的治療提供了一種新的思路，主要結論有:
　　1.成功構建了一種對胰腺癌細胞有抑制作用的以增殖性溶瘤腺病毒為載體的攜帶雙miRNAs的治療系統(tǒng)AdCEAp-miR34a-let7，該系統(tǒng)在胰腺癌細胞中特異性增殖，而在正常成纖維細胞中增殖不明顯;在胰腺癌細胞中具有表達腺病毒Ela基因的能力，能在胰腺癌細胞系中高水平表達miR-34a及miR-let7，而在正常成纖維細胞中不表達，進一步說明該治療系統(tǒng)的腫瘤細胞