表達(dá)非分泌白介素12的新型溶腫瘤腺病毒對(duì)敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌的治療作用.pdf

1、本研究構(gòu)建了三個(gè)基因刪除(TD)并表達(dá)非分泌IL-12(nsIL-12)的新型溶腫瘤腺病毒Ad-TD-nsIL-12。在具有完整免疫系統(tǒng)的敘利亞倉(cāng)鼠體內(nèi)進(jìn)行了Ad-TD-nsIL-12的抗腫瘤效果和安全性研究。
　　第一部分 新型溶腫瘤腺病毒的構(gòu)建與鑒定
　　1 目的:構(gòu)建并鑒定具有腫瘤靶向性和表達(dá)免疫治療基因的新型溶腫瘤腺病毒。
　　2 方法:2.1 高保真酶克隆目的基因，插入含有左右同源臂的穿梭質(zhì)粒載體中，構(gòu)建重組

2、穿梭載體。2.2 將構(gòu)建好的重組穿梭質(zhì)粒線性化，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化與腺病毒載體在BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組。2.3 將構(gòu)建成功的腺病毒載體線性化，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，生成有感染能力的病毒。批量生產(chǎn)并純化病毒。純化后的病毒進(jìn)行全基因組測(cè)序，ELISA檢測(cè)細(xì)胞感染病毒后IL-12的表達(dá)水平。2.4 分離人、敘利亞倉(cāng)鼠和小鼠的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，在PHA刺激后，加入IL-12標(biāo)準(zhǔn)品和新型溶腫瘤病毒表達(dá)的IL-12，檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞增殖情況。

3、分離敘利亞倉(cāng)鼠的脾細(xì)胞，在PHA刺激后，加入人IL-12，檢測(cè)敘利亞倉(cāng)鼠脾細(xì)胞表達(dá)IFN-γ和TNF-α的表達(dá)。
　　3 結(jié)果:3.1 測(cè)序分析證實(shí)成功構(gòu)建了pssIL-12、pssnsIL-12和pssLUC重組穿梭載體。3.2 酶切鑒定和測(cè)序分析證實(shí)，成功構(gòu)建了新型溶腫瘤腺病毒載體Ad-TD-IL-12、Ad-TD-nsIL-12和Ad-TD-LUC.3.3 成功生產(chǎn)出高滴度的腺病毒，基因組測(cè)序表明病毒基因序列完全正確，ELI

4、SA結(jié)果顯示Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12均表達(dá)IL-12。3.4 Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12表達(dá)的人IL-12刺激人和敘利亞倉(cāng)鼠的PBMC的增殖，而不能刺激小鼠的PBMC的增殖。人IL-12能刺激敘利亞倉(cāng)鼠脾細(xì)胞表達(dá)IFN-γ，和TNF-α。
　　4 結(jié)論:成功構(gòu)建和生產(chǎn)了表達(dá)治療基因的新型靶向溶腫瘤腺病毒，并發(fā)現(xiàn)人IL-12對(duì)敘利亞倉(cāng)鼠免疫細(xì)胞有功能。
　　第二部分 新型溶腫瘤

5、腺病毒對(duì)敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌的治療作用
　　1 目的:檢測(cè)新型溶腫瘤腺病毒對(duì)胰腺癌的治療作用。
　　2 方法:2.1 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)（MTS法）檢測(cè)dl1520和新型溶腫瘤腺病毒對(duì)敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌和腎癌細(xì)胞系的殺傷作用。2.2 通過(guò)復(fù)制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)dl1520和新型溶腫瘤腺病毒在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力。2.3 構(gòu)建敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌HPD1NR皮下腫瘤模型，當(dāng)腫瘤體積為80mm3和160mm3時(shí)，檢測(cè)dl520和Ad-TD-LU

6、C的治療作用;當(dāng)腫瘤體積達(dá)到310mm3時(shí)，檢測(cè)Ad-TD-LUC，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12的治療作用。2.4 構(gòu)建敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌Hap-T1原位腫瘤模型，檢測(cè)不同劑量下Ad-TD-LUC，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12的治療作用。2.5 構(gòu)建敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌腹腔播散腫瘤模型，檢測(cè)不同劑量下Ad-TD-LUC，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12的治療作用。
　　3 結(jié)

7、果:3.1 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新型溶腫瘤腺病毒對(duì)敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌和腎癌細(xì)胞系的殺傷作用比dl1520更強(qiáng)。3.2 病毒復(fù)制實(shí)驗(yàn)表明新型溶腫瘤腺病毒比dl1520在正常細(xì)胞中復(fù)制能力弱，在腫瘤細(xì)胞中比dl1520強(qiáng)。3.3 在敘利亞倉(cāng)鼠倉(cāng)鼠胰腺癌HPD1NR皮下腫瘤模型中，當(dāng)腫瘤體積為80mm3和160mm3時(shí)，dl520和Ad-TD-LUC都對(duì)腫瘤具有較好的治療作用;當(dāng)腫瘤體積為160mm3時(shí)，dl520無(wú)明顯療效，但Ad-TD-LUC能

8、顯著抑制腫瘤生長(zhǎng);當(dāng)腫瘤體積達(dá)到310mm3時(shí)，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12能完全治愈腫瘤，而Ad-TD-LUC無(wú)明顯腫瘤抑制作用。3.4 在低劑量下，Ad-TD-nsIL-12能顯著提高荷胰腺癌Hap-T1原位腫瘤的敘利亞倉(cāng)鼠生存率，Ad-TD-LUC無(wú)明顯治療效果，而Ad-TD-IL-12導(dǎo)致全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比對(duì)照組死亡更早。在提高Ad-TD-LUC和Ad-TD-nsIL-12的劑量和降低Ad-TD-IL-12的劑

9、量后，Ad-TD-nsIL-12能顯著提高敘利亞倉(cāng)鼠生存率，Ad-TD-LUC和Ad-TD-IL-12無(wú)明顯治療效果，低劑量Ad-TD-IL-12仍導(dǎo)致部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比對(duì)照組死亡更早。3.5 在敘利亞倉(cāng)鼠倉(cāng)鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散腫瘤模型中，Ad-TD-LUC能顯著提高荷敘利亞倉(cāng)鼠生存率，Ad-TD-nsIL-12能治愈所有荷瘤動(dòng)物，而高中低三個(gè)劑量的Ad-TD-IL-12都不能顯著提高荷敘利亞倉(cāng)鼠生存率。在給予一次大劑量的Ad-TD-

10、nsIL-12也能治愈所有荷瘤動(dòng)物。
　　4 結(jié)論:Ad-TD-nsIL-12在不同的胰腺癌腫瘤模型中具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用和安全性。
　　第三部分 新型溶腫瘤腺病毒的安全性和抗腫瘤機(jī)制研究
　　1 目的:檢測(cè)Ad-TD-nsIL-12的安全性和抗腫瘤作用機(jī)制。
　　2 方法:2.1 采用生化分析儀檢測(cè)敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌腹腔播散模型在腹腔注射溶腫瘤腺病毒后在第1，3，5天外周血中反映肝功能的酶水平和IL-12的表達(dá)情

11、況。HE染色檢測(cè)敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌原位模型在腹腔注射溶腫瘤腺病毒后在第1和3天肝臟細(xì)胞損傷情況。2.2 將胰腺癌皮下腫瘤模型療效實(shí)驗(yàn)中Ad-TD-IL-12或者Ad-TD-nsIL-12治療組腫瘤全部被清除的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重新接種原皮下接種的胰腺癌腫瘤細(xì)胞HPD1NR和腎癌細(xì)胞Hak，其中一組在接種HPD1NR的前一天腹腔注射CD3刪除抗體。在敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散模型治療40天后，在腹腔重新接種SHPC6。2.3 構(gòu)建敘利亞倉(cāng)鼠倉(cāng)

12、鼠胰腺癌HPD1NR皮下腫瘤模型，當(dāng)腫瘤體積為300mm3時(shí)，腹腔內(nèi)注射對(duì)照抗體，CD3和CD4刪除抗體，第二天開(kāi)始腫瘤內(nèi)注射Ad-TD-nsIL-12進(jìn)行治療，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。2.4 構(gòu)建敘利亞倉(cāng)鼠倉(cāng)鼠胰腺癌HPD1NR皮下腫瘤模型，當(dāng)腫瘤體積為300mm3時(shí)，腫瘤內(nèi)注射一次新型溶腫瘤腺病毒進(jìn)行治療，在第3，7，21天分別取動(dòng)物的脾臟、引流淋巴結(jié)和腫瘤組織，分別進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化檢測(cè)脾臟、引流淋巴結(jié)和腫瘤組

13、織的免疫細(xì)胞群和細(xì)胞因子的變化。2.5 構(gòu)建敘利亞倉(cāng)鼠倉(cāng)鼠胰腺癌Hap-T1原位腫瘤模型，腹腔內(nèi)注射新型溶腫瘤腺病毒進(jìn)行治療，在不同時(shí)間點(diǎn)分別取動(dòng)物的肝臟、外周血和腫瘤組織，分別進(jìn)行ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化檢測(cè)IL-12表達(dá)、免疫細(xì)胞群和病毒蛋白的變化。2.6 將nsIL-12基因插入到溶腫瘤痘苗病毒和腺病毒11載體中，構(gòu)建了VV-nsIL-12和Ad11-nsIL-12。構(gòu)建敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散腫瘤模型，

14、檢測(cè)不同劑量下VV-nsIL-12和Ad11-nsIL-12的治療作用。
　　3 結(jié)果:3.1 生化分析顯示Ad-TD-nsIL-12和對(duì)照病毒Ad-TD-LUC不引起明顯的肝功能的酶AST、ALT和ALP水平的升高，而Ad-TD-IL-12引起肝功能的酶水平顯著增高;在外周血中Ad-TD-IL-12高表達(dá)IL-12，而Ad-TD-nsIL-12持續(xù)表達(dá)低水平的IL-12。3.2 當(dāng)胰腺癌皮下腫瘤模型療效實(shí)驗(yàn)中的腫瘤全部被清除的實(shí)

15、驗(yàn)動(dòng)物重新接種原皮下接種的腫瘤細(xì)胞HPD1NR時(shí)，不能形成腫瘤;接種的腎癌細(xì)胞Hak腫瘤持續(xù)生長(zhǎng);在接種HPD1NR的前一天腹腔注射CD3刪除抗體的動(dòng)物的腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)。荷胰腺癌腹腔播散模型的敘利亞倉(cāng)鼠經(jīng)治療40天后重新接種SHPC6，90％實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未復(fù)發(fā)。3.3 敘利亞倉(cāng)鼠倉(cāng)鼠胰腺癌HPD1NR皮下腫瘤模型，在Ad-TD-nsIL-12治療的前一天腹腔內(nèi)注射對(duì)照抗體，CD3和CD4刪除抗體。CD4刪除抗體和對(duì)照抗體不影響Ad-TD-ns

16、IL-12的抗腫瘤效果，而CD3刪除抗體能抑制Ad-TD-nsIL-12抗腫瘤作用。3.4 在腫瘤組織中，Ad-TD-nsIL-12和Ad-TD-IL-12對(duì)腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞有相同的影響。在脾臟、引流淋巴結(jié)和腫瘤組織中，Ad-TD-nsIL-12和Ad-TD-IL-12引起促進(jìn)抗腫瘤作用的相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)增高。Ad-TD-nsIL-12僅能在第7天使引流淋巴結(jié)的CD4+和CD3+CD4-T細(xì)胞增加，不影響脾臟內(nèi)T細(xì)胞的增殖，而Ad-T

17、D-IL-12除了能在第7天使引流淋巴結(jié)的CD3+CD4-T細(xì)胞增加外，在3，7，21天還影響脾臟內(nèi)CD3+CD4-T細(xì)胞的增殖。3.5 腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示，Ad-TD-nsIL-12能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示溶腫瘤病毒主要靶向腫瘤細(xì)胞。免疫組化顯示病毒在腫瘤組織內(nèi)復(fù)制，并且導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞增加。HE染色顯示Ad-TD-nsIL-12對(duì)肝臟無(wú)明顯毒性。3.6 敘利亞倉(cāng)鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散腫瘤模型，在經(jīng)過(guò)VV-