組織特異性溶瘤腺病毒對(duì)膀胱腫瘤干細(xì)胞的作用.pdf

1、目的：每年新發(fā)膀胱腫瘤中，大約70％的是非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切除術(shù)手術(shù)和膀胱內(nèi)化療藥物灌注是目前最主要的治療方式，但經(jīng)過(guò)治療后，5年內(nèi)仍將近一半的膀胱腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)或進(jìn)展成肌層浸潤(rùn)性膀胱癌。學(xué)者們認(rèn)為這可能與膀胱腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。膀胱腫瘤干細(xì)胞是存在于膀胱腫瘤中的少數(shù)具有自我更新和增殖分化潛能的細(xì)胞，膀胱腫瘤的化療藥物抵抗、復(fù)發(fā)和進(jìn)展與膀胱腫瘤干細(xì)胞的存在密切相關(guān)。該次研究應(yīng)用ALDEFLUOR kit分選試劑盒通過(guò)流式細(xì)胞

2、儀分選膀胱腫瘤干細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞鑒定；測(cè)定膀胱腫瘤干細(xì)胞表面C AR和CD46的表達(dá)情況；用本實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建完成的膀胱組織特異性溶瘤腺病毒感染膀胱腫瘤干細(xì)胞，觀察Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR(APU-E1A-AR)膀胱腫瘤特異性溶瘤腺病毒對(duì)膀胱腫瘤干細(xì)胞的殺傷效果。
　　方法：常規(guī)培養(yǎng)膀胱腫瘤細(xì)胞株T24和EJ。應(yīng)用ALDEFLUOR kit分選試劑盒通過(guò)流式細(xì)胞儀分選膀胱腫瘤干細(xì)胞；首先，用無(wú)血清平板克隆形

3、成實(shí)驗(yàn)觀察膀胱腫瘤干細(xì)胞的克隆形成能力，用40uM順鉑干預(yù)膀胱腫瘤細(xì)胞，測(cè)定存活細(xì)胞內(nèi)ALDH的表達(dá)情況，繼續(xù)培養(yǎng)分選得到的膀胱腫瘤干細(xì)胞一段時(shí)間后，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ALDH的表達(dá)情況，觀察膀胱腫瘤干細(xì)胞是否有部分發(fā)生分化。綜合膀胱腫瘤干細(xì)胞的克隆形成能力、化療藥物抵抗及分化能力對(duì)分選所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定。其次，提取膀胱腫瘤細(xì)胞及膀胱腫瘤干細(xì)胞RNA，用 RT-PCR法測(cè)定膀胱腫瘤干細(xì)胞中CAR基因和CD46基因的表達(dá)情況，比較兩種細(xì)胞內(nèi)CAR與

4、CD46的表達(dá)是否有差異；用細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)膀胱腫瘤干細(xì)胞表面CAR和CD46的情況，同時(shí)將其表達(dá)量與未分選膀胱腫瘤細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比；用MTT法檢測(cè)膀胱組織特異性溶瘤腺病毒殺傷膀胱腫瘤干細(xì)胞的最佳病毒滴度和干預(yù)時(shí)間，用分選得到的最佳干預(yù)方案對(duì)膀胱腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，在光學(xué)顯微鏡下觀察膀胱組織特異性溶瘤腺病毒對(duì)膀胱腫瘤干細(xì)胞的干預(yù)效果。
　　結(jié)果：經(jīng)過(guò)分選發(fā)現(xiàn)，約有15%的膀胱腫瘤細(xì)胞內(nèi)是膀胱腫瘤干細(xì)胞，與未經(jīng)分選的膀胱腫瘤相比，膀

5、胱腫瘤干細(xì)胞的克隆形成能力強(qiáng)，可繼續(xù)分化出ALDH（—）細(xì)胞，并具有化療藥物抵抗能力，以上一系列表現(xiàn)均符合腫瘤干細(xì)胞的特性。RT—PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱腫瘤干細(xì)胞表面CAR基因的表達(dá)較未分選膀胱腫瘤細(xì)胞低，兩種腫瘤細(xì)胞內(nèi)的CD46基因表達(dá)無(wú)明顯差異；細(xì)胞組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱腫瘤干細(xì)胞內(nèi)CAR的表達(dá)較未分選腫瘤細(xì)胞低，兩者的CD46表達(dá)都比較高。通過(guò)MTT法發(fā)現(xiàn)，病毒MOI值為80，干預(yù)48h后，超過(guò)一半的膀胱腫瘤干細(xì)胞發(fā)生裂解死亡，