一種嵌合型不依賴于CAR的膀胱癌特異性溶瘤腺病毒構(gòu)建及其抗膀胱癌作用研究.pdf

1、目的：膀胱癌是泌尿系統(tǒng)疾病中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且隨著空氣污染的加重和吸煙人數(shù)的增加膀胱癌的發(fā)病率逐年增高。膀胱癌的治療多采用手術(shù)、放療、化療和灌注療法，但這些方法尚存在遠(yuǎn)期治愈率低、復(fù)發(fā)率高的缺點(diǎn)。近些年膀胱癌的基因治療成為了一個(gè)新興的治療手段，其中通過(guò)構(gòu)建攜帶目的基因的溶瘤腺病毒靶向殺傷膀胱癌細(xì)胞是一個(gè)新的研究方向。大部分關(guān)于膀胱癌溶瘤腺病毒生物治療的研究中，應(yīng)用的載體多為5型腺病毒，該病毒主要通過(guò)識(shí)別膀胱癌細(xì)胞表面的柯薩奇-腺病

2、毒受體（coxsackie adenovirus receptor,CAR）進(jìn)入腫瘤細(xì)胞發(fā)揮溶瘤作用。但是對(duì)于一些分化程度低的腫瘤細(xì)胞，其表面CAR的表達(dá)量低，從而阻礙了5型腺病毒發(fā)揮抗膀胱癌作用。因此，本課題致力于構(gòu)建一種不依賴于CAR的嵌合型膀胱癌特異性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，該病毒可以通過(guò)膀胱癌廣譜表達(dá)的CD46分子進(jìn)入腫瘤細(xì)胞發(fā)揮溶瘤作用。順鉑是膀胱癌的治療中較為常用的一種化療藥物，我們通過(guò)一系

3、列體外實(shí)驗(yàn)研究Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A聯(lián)合順鉑是否具有協(xié)同抗腫瘤作用。不依賴于CAR的嵌合型溶瘤腺病毒的構(gòu)建及其與順鉑的聯(lián)合應(yīng)用為膀胱癌的基因治療提供了一個(gè)新的思路，拓展了膀胱癌治療領(lǐng)域。
　　方法：將嵌合5型腺病毒纖毛尾區(qū)和11型腺病毒纖毛軸區(qū)及旋鈕區(qū)的骨架質(zhì)粒 Ad5/F11p，與我們實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒Rp-PSCAE-UPII-E1A在大腸桿菌 BJ5183中進(jìn)行同源重組形成重組質(zhì)粒pAd5/F1

4、1p-PSCAE-UPII-E1A，并通過(guò)限制性內(nèi)切酶和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR)這兩種方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。根據(jù) pAdEasy-1系統(tǒng)，重組質(zhì)粒pAd5/F11p-PSCAE-UPII-E1A在HEK293細(xì)胞內(nèi)包裝出不依賴于CAR的嵌合型膀胱組織特異性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，通過(guò)PCR的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，對(duì)鑒定正確的病毒進(jìn)行純化、擴(kuò)增和滴度測(cè)定。

5、將新構(gòu)建的溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A作用于5637、EJ和 T24三種膀胱癌細(xì)胞，通過(guò)CCK-8、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、RNA干擾技術(shù)及流失細(xì)胞術(shù)等方法測(cè)定Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A對(duì)不同CAR表達(dá)情況的膀胱癌細(xì)胞的抗腫瘤作用，以及探討Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期的影響。最后通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究Ad5/F11p-PS

6、CAE-UPII-E1A聯(lián)合順鉑對(duì)5637、EJ和T24三種膀胱癌細(xì)胞的抗腫瘤作用，并通過(guò)對(duì)相關(guān)凋亡基因Fas、Bax、Bcl-2及cleaved Caspase3的檢測(cè)初步探討Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A聯(lián)合順鉑抗膀胱癌的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：（1）我們將嵌合5型腺病毒纖毛尾區(qū)和11型腺病毒纖毛軸區(qū)及旋鈕區(qū)的骨架質(zhì)粒 Ad5/F11p，和穿梭質(zhì)粒Rp-PSCAE-UPII-E1A進(jìn)行同源重組，經(jīng)鑒定形成了正確的

7、重組質(zhì)粒pAd5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，并根據(jù)pAdEasy-1包裝系統(tǒng)，包裝出了不依賴于CAR的嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，通過(guò)純化、擴(kuò)增及病毒滴度測(cè)定，我們得到的病毒滴度為1×1010PFU/ml。（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示在5637、EJ及T24細(xì)胞中，T24細(xì)胞CAR的表達(dá)量低，而5637、EJ及 T24這三種細(xì)胞均高表達(dá) CD46分子。（3） Ad5/F11p-PSC

8、AE-UPII-E1A可以進(jìn)入CAR高表達(dá)5637、EJ細(xì)胞和CAR低表達(dá)的T24進(jìn)行復(fù)制，并發(fā)揮抗腫瘤作用，且殺傷作用均優(yōu)于Ad5-PSCAE-UPII-E1A，而對(duì)人正常尿路上皮細(xì)胞株 SV-HUC-1均無(wú)殺傷作用。（4）嵌合型病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A進(jìn)入膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制發(fā)揮抗腫瘤作用和細(xì)胞表面CAR的表達(dá)量無(wú)關(guān)：該病毒分別感染未經(jīng)CAR-SiRNA處理的膀胱癌細(xì)胞（EJ、5637、T24）和 CAR-S

9、iRNA干擾的膀胱癌細(xì)胞（ EJ-CAR-SiRNA、5637-CAR-SiRNA、T24-CAR-SiRNA）后，E1A蛋白的表達(dá)和體外抗增殖作用在在EJ和EJ-CAR-SiRNA、5637和5637-CAR-SiRNA、T24和T24-CAR-SiRNA之間無(wú)差異。（5）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A感染5637、EJ及T24這三種膀胱癌細(xì)胞后可以阻滯大部分膀胱癌細(xì)胞周期于 G1期。（6） Ad5/F11p-PSCA

10、E-UPII-E1A聯(lián)合順鉑作用于5637、EJ及T24這三種膀胱癌細(xì)胞后具有協(xié)同抗膀胱癌作用。（7）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A聯(lián)合順鉑可以誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，且發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞數(shù)目多于順鉑單用組和Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A單用組。（8）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A聯(lián)合順鉑作用于5637、EJ及T24這三種膀胱癌細(xì)胞后可以上調(diào)Fas、Bax和cleaved Caspas

11、e3基因的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)。
　　結(jié)論：我們構(gòu)建出了一種不依賴于CAR的嵌合型膀胱癌特異性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，經(jīng)純化、鑒定和滴度測(cè)定，該病毒純度好滴度高可用于后續(xù)研究；這種嵌合型病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A可進(jìn)入5637、EJ及T24這三種膀胱癌細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用，且效果優(yōu)于 Ad5-PSCAE-UPII-E1A；Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1