攜帶人源化的綠色熒光蛋白膀胱癌組織特異性報(bào)告基因腺病毒的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶人源化的綠色熒光蛋白(hrGFP。humanizedgreen fluorescentprotein)膀胱癌組織特異性報(bào)告基因腺病毒載體Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP，為檢測(cè)膀胱癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞提供了一種新的檢測(cè)方法。
　　方法：根據(jù)圖譜選取BglII和 PmeI兩種限制性內(nèi)切酶分別對(duì)pShuttle-CMV-IRES-hrGFP和 pShuttle-PSCAE-UPII-E1A進(jìn)行分步酶切

2、。pShuttle-CMV-IRES-hrGFP酶切后獲得 IRES-hrGFP目的片段。pShuttle-PSCAE-UPII-E1A酶切后獲得 PSCAE-UPII-E1A目的片段，對(duì)IRES-hrGFP目的片段和PSCAE-UPII-E1A目的片段進(jìn)行膠回收。將回收得的兩個(gè)片段IRES-hrGFP目的片段和PSCAE-UPII-E1A目的片段使用T4連接酶連接,16°恒溫箱過(guò)夜，連接液轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中、涂板，16小時(shí)后選

3、取陽(yáng)性克隆，過(guò)夜搖菌，用菌液聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、基因測(cè)序（IRES-hrGFP片段）鑒定新構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒 pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。將pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP用酶 PmeI線性化后,電擊法轉(zhuǎn)化到含pAdEasy的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化、涂板后選取陽(yáng)性克隆，過(guò)夜搖菌，重組后的質(zhì)粒Ad-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP經(jīng)過(guò)酶切

4、（PacI、BsphI）、菌液PCR鑒定正確后,通過(guò)脂質(zhì)體lipfectamine2000轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞HEK293，包裝成膀胱癌組織特異性報(bào)告基因腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。
　　結(jié)果：pShuttle-CMV-IRES-hrGFP和pShuttle-PSCAE-UPII-E1A經(jīng)過(guò)BglII和PmeI酶切后膠回收目的片段，將兩個(gè)目的片段用T4連接酶連接，形成新的穿梭質(zhì)粒pShuttle-P

5、SCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,新構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1 A-IRES-hrGFP經(jīng)PCR鑒定和IRES-hrGFP基因測(cè)序鑒定，成功后利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法制備出組織特異性膀胱癌的腺病毒載體pAd-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP，經(jīng)酶切和PCR鑒定后，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至HEK293，熒光顯微鏡觀察到 hrGFP基因的表達(dá)，包裝成報(bào)告基因腺病毒Ad5-PSCAE-UP