攜綠色熒光蛋白的人低氧誘導因子1α及其突變型重組腺病毒載體的構建及鑒定.pdf

1、背景 缺血性心臟病目前常規(guī)治療包括藥物治療、冠脈介入(PCI)及冠脈旁路移植術(CABG)，然而相當一部分患者藥物治療難以見效，也不適于常規(guī)血管再通術處理，另外還有些患者經(jīng)過上述處理后仍然存在冠脈再狹窄、心肌微、小血管功能障礙、心功能低下，因此必須尋求其它方法。近年來，隨著分子生物學的巨大進步，基因治療促缺血心肌血管新生已成為冠脈血運重建術中具有發(fā)展前景的新方向，目前血管新生是生物學界基因治療發(fā)展最快的領域。促血管生長因子研究較

2、多的有VEGF、FGF等，雖然Ⅰ期臨床試驗結果證明安全有效，但Ⅱ期臨床試驗結果并不理想，資料顯示VEGF可導致新生血管組織水腫、血管通透性增高、易發(fā)生炎癥反應等，甚至可能促進動脈硬化進展，毛細血管過度增殖及血管瘤形成等，F(xiàn)GF治療則與蛋白尿有關。血管生長過程本身受一系列生長因子的調(diào)節(jié)，是個復雜的過程，單個生長因子治療并不足以誘導成熟的血管新生。低氧誘導因子-1(hypoxiainduciblefactor1，HIF-1)是細胞對缺氧作出

3、適應性反應的上游關鍵性轉錄因子，通過對VEGF、Ang、EPO、PDGF、HO-1等60多種靶基因的轉錄調(diào)控參與了血管新生、紅細胞生成等病理生理過程。臨床前期研究表明，應用具有組成型表達活性的HIF-1α基因治療可誘導生理功能完整的血管新生。HIF-1α誘導的新生血管具有無明顯炎癥反應、不滲漏、不引起組織水腫的特點，此外，HIF-1α還可以促進EPO、HO-1、INOS等基因的轉錄，具有抗細胞凋亡、改善心肌細胞代謝等血管新生以外的作用。

4、因此，人們對HIF-1α的促血管新生治療給予厚望。HIF-1具有α、β兩個亞單位，HIF-1α受氧濃度的調(diào)節(jié)，決定HIF-1的活性。但HIF-1α常氧下容易降解，主要與常氧狀態(tài)下HIF-1αODDD區(qū)Pro564和Pro402發(fā)生羥基化導致其水解有關，突變其中任一位點的單突變型HIF-1α在常氧下都可以得到表達；而Pro804突變可以促進靶基因的轉錄。綠色熒光蛋白(EGFP)是基因工程中常用的標記物，不影響目標基因的效應，其突出的有點在

5、于EGFP與蛋白偶聯(lián)后可在活體細胞或生物體內(nèi)動態(tài)觀察目標蛋白的表達、分布及其效應。腺病毒載體較其他病毒載體具有制備容易、感染譜廣、病毒滴度高、表達時間短(1-2周)，不引起插入突變等優(yōu)點而成為治療性血管新生最具臨床應用價值的載體之一。我們在將Pro564定點突變?yōu)锳la564、Pro803定點突變?yōu)锳la803及表達分析的基礎上，在解決了HIF-1α在常氧下蛋白穩(wěn)定和促進轉錄的基礎上，為更直觀的研究HIF-1α基因及其突變型在細胞和動物

6、中的分布、表達和效應，擬構建攜EGFP的含HIF-1α、HIF-1α-Ala564及HIF-1α-Ala564-Ala802基因的重組腺病毒載體Adeno-EGFP-HIF-1α、Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564、Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala802，為研究HIF-1α基因及其突變型對缺血性心臟病的血管新生作用及以后的臨床應用奠定基礎。 目的 構建能在哺乳動物細胞得到外源基因高表

7、達的攜帶EGFP和HIF-1α及其突變型HIF-1α-Ala564、HIF-1α-Ala564-Ala803基因的重組腺病毒載體Adeno-EGFP-HIF-1α、Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564及Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803，為更直觀的研究HIF-1α基因及其突變型對缺血性心臟病的血管新生作用及以后的臨床應用奠定基礎。 方法 采用體外連接的重組腺病毒方法，由表達質(zhì)粒pc

8、DNA3.1(+)-HIF-1α、pcDNA3.1(+)-HIF-1α-Ala564及pcDNA3.1(+)-HIF-1α-Ala564-Ala803通過KpnI、ApaI雙酶切獲得包括起始密碼子在內(nèi)的HIF-1α、HIF-1α-Ala564、HIF-1α-Ala564-Ala803的eDNA片段，克隆到質(zhì)粒pEGFP-C1，得到pEGFP-HIF-1α-c1、pEGFP-HIF-1α-Ala564-c1及pEGFP-HIF-1α-Al

9、a564-Ala804-c1。行酶切和PCR鑒定成功后以Nhel、Apal雙酶切得到EGFP-HIF1α、EGFP-HIF-1α-Ala564、EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803cDNA，重組到穿梭質(zhì)粒pShuttle2，得到重組穿梭質(zhì)粒pShuttle2-EGFP-HIF-1α、pShuttle2-EGFP-HIF-1α-Ala564及pShuttle2-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala804，行酶切和PC

10、R鑒定。穿梭質(zhì)粒pShuttle2的人巨細胞病毒啟動子(hCMV)和SV40多聚腺苷酸尾(polyA)之間的多克隆位點間，以PI-SceI和I-CeuI雙酶切重組穿梭質(zhì)粒，獲得含有CMV-EGFP-HIF1α、CMV-EGFP-HIF-1α-Ala564、CMV-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803cDNA的表達盒，與線性化的腺病毒骨架質(zhì)粒Adeno-XViralDNA連接，經(jīng)SwaI酶切去除Adeno-XViralDNA

11、自身環(huán)化質(zhì)粒，再轉化感受態(tài)DH5α，重組成pAdeno-EGFP-HIF1α、pAdeno-EGFP-HIF-1α-Ala564及pAdeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803腺病毒質(zhì)粒，鑒定成功后再分別經(jīng)PacI酶切線性化并暴露其兩端的反向重復序列(ITRs)，脂質(zhì)體法轉染HEK293細胞，熒光顯微鏡下觀察結果，待出現(xiàn)細胞病變效應后收集細胞，-70℃～37℃反復凍融細胞3次得到含重組病毒的病毒液，終點稀釋實驗法測定病

12、毒滴度，包裝成為重組Adeno-EGFP-HIF1α、Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564及Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803腺病毒。取部分病毒液加入HEK293細胞中擴增病毒，并進行PCR、測序鑒定及滴度測定。 結果 經(jīng)酶切、PCR鑒定及基因測序證實重組質(zhì)粒pEGFP-HIF-1α-c1、pEGFP-HIF-1α-Ala564-c1、pEGFP-HIF-1α-Ala564-Ala

13、804-c1構建成功，重組穿梭質(zhì)粒pShuttle2-EGFP-HIF-1α、pShuttle2-EGFP-HIF-1α-Ala564及pShuttle2-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala804及重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-EGFP-HIF1α、pAdeno-EGFP-HIF-1α-Ala564及pAdeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803構建成功。重組腺病毒質(zhì)粒轉染HEK293細胞綠色熒光顯微鏡下觀察顯

14、示轉染效率約20％-30％，10-14天即可出現(xiàn)細胞病變效應。經(jīng)測序證實重組腺病毒Adeno-EGFP-HIF1α中的HIF1αcDNA564位為脯氨酸(Pro)密碼子CCC；重組腺病毒Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564的HIF-1αcDNA564位為脯氨酸密碼子CCC突變?yōu)楸彼?Ala)密碼子GCC，803位為天冬酰胺(Asn)密碼子AAT；重組腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803的HIF-1αc

15、DNA564位脯氨酸密碼子CCC突變?yōu)楸彼?Ala)密碼子GCC，803位天冬酰胺(Asn)密碼子AAT突變?yōu)楸彼?Ala)密碼子GCT。包裝后反復凍融細胞3次得到含重組病毒的病毒液，加入到HEK293可見細胞病變效應(CPE)，擴增病毒后提病毒DNA行PCR檢測重組腺病毒均得到預期的460、214、287bp目的片斷，終點稀釋實驗法檢測重組腺病毒Adeno-EGFP-HIF1α、Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564及A

16、deno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803的滴度分別為1.3×108pfu/ml、2.0×108pfu/ml和1.8×108pfu/ml。 結論 成功構建重組腺病毒Adeno-EGFP-HIF-1α、Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564及Adeno-EGFP-HIF-1α-Ala564-Ala803(對照載體Adeno-EGFP已由童鍇同學構建)，為缺血性心臟病的HIF-1α基因治療研究奠定