人三突變型低氧誘導(dǎo)因子1α腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、背景：缺血性心臟病目前常規(guī)治療包括藥物治療、冠脈介入(PCI)及冠脈旁路移植術(shù)(CABG)，然而相當(dāng)一部分患者藥物治療難以見(jiàn)效，也不適于常規(guī)血管再通術(shù)處理，另外還有些患者經(jīng)過(guò)上述處理后仍然存在冠脈再狹窄、心肌微、小血管功能障礙、心功能低下，因此必須尋求其它方法。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的巨大進(jìn)步，基因治療促缺血心肌血管新生已成為冠脈血運(yùn)重建術(shù)中具有發(fā)展前景的新方向，目前血管新生是生物學(xué)界基因治療發(fā)展最快的領(lǐng)域。促血管生長(zhǎng)因子研究較多的有V

2、EGF、FGF等，雖然I期臨床試驗(yàn)結(jié)果證明安全有效，但I(xiàn)I期臨床試驗(yàn)結(jié)果并不理想，資料顯示VEGF可導(dǎo)致新生血管組織水腫、血管通透性增高、易發(fā)生炎癥反應(yīng)等，甚至可能促進(jìn)動(dòng)脈硬化進(jìn)展，毛細(xì)血管過(guò)度增殖及血管瘤形成等，F(xiàn)GF治療則與蛋白尿有關(guān)。血管生長(zhǎng)過(guò)程本身受一系列生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)，是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，單個(gè)生長(zhǎng)因子治療并不足以誘導(dǎo)成熟的血管新生。低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxiainduciblefatctor1，HIF-1)是細(xì)胞對(duì)缺氧作出適應(yīng)

3、性反應(yīng)的上游關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)對(duì)VEGF、Ang、EPO、PDGF、HO-1等60多種靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與了血管新生、紅細(xì)胞生成等病理生理過(guò)程。臨床前期研究表明，應(yīng)用具有組成型表達(dá)活性的HIF-1a基因治療可誘導(dǎo)生理功能完整的血管新生。HIF-1a誘導(dǎo)的新生血管具有無(wú)明顯炎癥反應(yīng)、不滲漏、不弓l起組織水腫的特點(diǎn)，此外，HIF-1a還可以促進(jìn)EPO、HO-1、INOS等基因的轉(zhuǎn)錄，具有抗細(xì)胞凋亡、改善心肌細(xì)胞代謝等血管新生以外的作用。因

4、此，人們對(duì)HIF-1a的促血管新生治療給予厚望。HIF-1具有a、β兩個(gè)亞單位，HIF-1a受氧濃度的調(diào)節(jié)，決定HIF-1的活性。但HIF-1a常氧下容易降解，主要與常氧狀態(tài)下HIF-1aODDD區(qū)Pro564和Pro402發(fā)生羥基化導(dǎo)致其水解有關(guān)，突變其中任一位點(diǎn)的單突變型HIF-1a在常氧下都可以得到表達(dá)；而Asn804突變可以促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。腺病毒載體較其他病毒載體具有制備容易、感染譜廣、病毒滴度高、表達(dá)時(shí)間短(1-2周)，不引

5、起插入突變等優(yōu)點(diǎn)而成為治療性血管新生最具臨床應(yīng)用價(jià)值的載體之一。我們?cè)诜謩e將Pr0402、Pr0564、Asn803定點(diǎn)突變?yōu)锳la402、Ala564、Ala803及表達(dá)分析的基礎(chǔ)上，在解決了HIF-1a在常氧下蛋白穩(wěn)定和促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)上，通過(guò)重組到穿梭質(zhì)粒pShuttle2，采用體外連接的重組腺病毒構(gòu)建技術(shù)，構(gòu)建能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞得到外源基因高表達(dá)的攜帶Adeno-HIF-1a-Ala402-Ala564-Ala803，解決了HIF-

6、1a基因的高效表達(dá)問(wèn)題，促進(jìn)HIF-1a基因及其突變型對(duì)缺血性心臟病的血管新生作用的進(jìn)一步研究。 目的：為了深入研究人低氧誘導(dǎo)因子1a基因?qū)谛牟〉难苄律饔?，?gòu)建人三突變型低氧誘導(dǎo)因子1a真核表達(dá)載體(pShuttle2-HIF-1a-Ala402-Ala564-Ala803)和腺病毒表達(dá)載體(pAdeno-HIF-1a-Ala402-Ala564-Ala803)。 方法：雙酶切pShuttle2-HIF-1a-Al

7、a402-Ala564、pShuttle2-HIF-1a-Ala564-Ala803，膠回收前者酶切片段中大小為300bp的小片段及后者酶切片段中大小為6300bp的大片段(含有HIF-1acDNA的表達(dá)盒片段)，通過(guò)體外連接法將兩者連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，重組成三突變型穿梭質(zhì)粒pShuttle2-HIF-1a-Ala402-Ala564-Ala803，并進(jìn)行酶切和PCR鑒定。鑒定正確后，采用分子克隆技術(shù)，以PI-SceI和I-Ceu

8、I雙酶切重組三突變型穿梭載體，獲得含有三突變型質(zhì)粒pShuttle2-HIF-1a-Ala402-Ala564-Ala803的表達(dá)盒，通過(guò)體外連接法與線性化的腺病毒骨架載體Adeno-XTMViralDNA連接，重組成三突變型腺病毒質(zhì)粒pAdeno-HIF-1a-Ala402-Ala564-Ala803，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確后，再分別經(jīng)PacI酶切線性化并暴露其兩端的反向重復(fù)序列(ITRs)，通過(guò)脂質(zhì)體lipofectamine2000

9、轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，待出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)后收集細(xì)胞，-70℃～37℃反復(fù)凍融細(xì)胞3次得到含重組病毒的病毒液，終點(diǎn)稀釋實(shí)驗(yàn)法測(cè)定病毒滴度，包裝成為重組三突變型pAdeno-HIF-1a-Ala402-Ala564-Ala803腺病毒，取部分病毒液加入HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增病毒，并進(jìn)行PCR、測(cè)序鑒定及滴度測(cè)定。 結(jié)果：經(jīng)酶切、PCR鑒定及基因測(cè)序證實(shí)重組穿梭質(zhì)粒pShuttle2-HIF-1-Ala402-Ala564-Al

10、a803及重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-HIF-1a-Ala402-Ala564-Ala803構(gòu)建成功。重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，10-14天即可出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)。經(jīng)測(cè)序證實(shí)重組腺病毒pAdeno-HIF-1aAla402-Ala564-Ala803中HIF-1acDNA中的HIF-1acDNA402位脯氨酸(Pro)密碼子CCA突變?yōu)楸彼?Ala)密碼子GCA；564位脯氨酸(Pro)密碼子CCC突變?yōu)楸彼?Ala)密碼子

11、GCC，803位天冬酰胺(Asn)密碼子AAT突變?yōu)楸彼?Ala)密碼子GCT。包裝后反復(fù)凍融細(xì)胞3次得到含重組病毒的病毒液，加入到HEK293可見(jiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，擴(kuò)增病毒后提病毒DNA行PCR檢測(cè)重組腺病毒均得到預(yù)期的380、460、214、287bp目的片斷，終點(diǎn)稀釋實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)重組腺病毒pAdeno-HIF-1a-Ala402-Ala564-Ala803的滴度2×109pfu/L。 結(jié)論：成功構(gòu)建人三突變型低氧誘導(dǎo)