凋亡誘導因子及其突變體的腺病毒載體構建和對K562細胞凋亡的影響.pdf

1、慢性粒細胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia,CML）是由于9號染色體與22號染色體易位形成Bcr-Abl融合基因而引起的惡性血液腫瘤，該融合基因編碼產生具有強酪氨酸激酶活性的BCR-ABL蛋白，該蛋白可通過激活下游多條信號通路，發(fā)揮促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用。因此，研究CML細胞凋亡被抑制的分子機制對CML發(fā)病機制及治療具有重要意義。
　　凋亡誘導因子（ Apoptosis-Inducing Fact

2、or, AIF）是參與非依賴caspase凋亡途徑的重要分子，它是一種黃素蛋白，正常情況下定位在線粒體內膜上，起著電子傳遞的作用，參與能量代謝。當細胞受到凋亡刺激后，AIF從線粒體異位到細胞漿，最后進入細胞核，將DNA切割成約50 kb的大片段，導致細胞凋亡。經研究發(fā)現(xiàn)，AIF從線粒體釋放與線粒體膜的通透性、鈣蛋白酶等有關，Luigi等在 Apaf1-/- HeLa細胞中發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-70（Heat Shock Protein-70,

3、 HSP70）能夠阻止AIF入核，從而阻止細胞發(fā)生凋亡樣細胞死亡。然而，AIF在CML細胞凋亡被抑制中的作用機制尚不清楚。
　　為了進一步了解AIF在CML發(fā)病中的作用，我們的研究思路是：構建野生型凋亡誘導因子（Ad-Apoptosis-inducing factor，Ad-AIF）、缺線粒體定位信號結構域的凋亡誘導因子突變體（Ad-Apoptosis-inducing factor defected mitochondria l

4、ocalization sign, Ad-DMLS-AIF）和缺HSP70結合位點的凋亡誘導因子突變體（ Ad-Apoptosis-inducing factor-defected HSP70 banding domain, Ad-DHBD-AIF）的重組腺病毒載體，感染白血病 K562細胞后，觀察 Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF對慢粒白血病K562細胞凋亡的作用，探討AIF與CML細胞凋亡異常之間的關系。

5、
　　主要的實驗內容及方法：
　　1.構建Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和 Ad-DHBD-AIF重組腺病毒載體。
　　將 K562細胞的cDNA作為模板，通過PCR得到的AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段分別克隆至穿梭載體pAd-Track-CMV-HA質粒中，經雙酶切、PCR和測序鑒定后，分別與骨架質粒pAd-Easy1重組，得到的重組腺病毒質粒分別經PacⅠ線性化后，轉染AD293細胞，進行包裝

6、和擴增，即得到Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和 Ad-DHBD-AIF重組腺病毒，同時將 pAd-Easy1質粒進行包裝和擴增，得到空載腺病毒，作為實驗對照。在空載腺病毒和三種重組腺病毒感染 K562細胞48 h時，通過western blot驗證其在K562細胞中的表達。
　　2.觀察Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和 Ad-DHBD-AIF對K562細胞凋亡的影響。
　　在空載腺病毒和三種重組腺病毒感染K562

7、細胞0 h、24 h、48 h、72 h時，使用CCK-8檢測各組腺病毒對K562細胞生長抑制的程度；在48 h時，通過Hoechst33258染色觀察K562細胞核形態(tài)的改變，流式細胞術檢測K562細胞凋亡情況；在24 h時，免疫熒光染色檢測重組腺病毒表達蛋白在 K562細胞中的定位，免疫共沉淀檢測 AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否與HSP70相結合。
　　通過以上方法，我們得到以下結果：
　　1.通過雙酶切

8、、PCR和測序鑒定，構建的穿梭質粒正確；PacⅠ酶切得到特異性的大小為4.5 kb的 DNA片段，說明 Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和 Ad-DHBD-AIF構建成功；Western blot檢測到三種重組腺病毒在K562細胞中的表達。
　　2. CCK-8實驗結果顯示與未處理組、空載腺病毒組、Ad-AIF組和Ad-DMLS-AIF組相比，隨著時間的增加， Ad-DHBD-AIF對K562細胞生長抑制程度也增加。Hoech

9、st33258染色發(fā)現(xiàn) Ad-DHBD-AIF引起K562細胞染色質凝集，而未處理組、空載腺病毒組、Ad-AIF組和Ad-DMLS-AIF組的K562細胞染色質分布均勻；流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)Ad-DHBD-AIF引起K562細胞凋亡的數(shù)目明顯高于未處理組、空載腺病毒組、Ad-AIF組和 Ad-DMLS-AIF組。免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)， DHBD-AIF能進入細胞核，AIF和Ad-DMLS-AIF均滯留于胞漿中；免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn) AIF和

10、 DMLS-AIF均能與 HSP70相結合，而DHBD-AIF不結合HSP70。
　　綜上所述，三種重組腺病毒構建成功，感染K562細胞后，與未處理組、空載腺病毒組、Ad-AIF組和 Ad-DMLS-AIF組相比， Ad-DHBD-AIF能夠引起K562細胞發(fā)生明顯凋亡，其表達的蛋白不與HSP70結合，并且能夠進入細胞核，說明在K562細胞中，AIF與HSP70結合可使 AIF滯留于胞漿中，不能發(fā)揮促凋亡的作用，從而表現(xiàn)出抵抗凋亡