凋亡誘導(dǎo)因子及其突變體的腺病毒載體構(gòu)建和對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血?。–hronic Myeloid Leukemia,CML）是由于9號(hào)染色體與22號(hào)染色體易位形成Bcr-Abl融合基因而引起的惡性血液腫瘤，該融合基因編碼產(chǎn)生具有強(qiáng)酪氨酸激酶活性的BCR-ABL蛋白，該蛋白可通過(guò)激活下游多條信號(hào)通路，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用。因此，研究CML細(xì)胞凋亡被抑制的分子機(jī)制對(duì)CML發(fā)病機(jī)制及治療具有重要意義。
　　凋亡誘導(dǎo)因子（ Apoptosis-Inducing Fact

2、or, AIF）是參與非依賴caspase凋亡途徑的重要分子，它是一種黃素蛋白，正常情況下定位在線粒體內(nèi)膜上，起著電子傳遞的作用，參與能量代謝。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激后，AIF從線粒體異位到細(xì)胞漿，最后進(jìn)入細(xì)胞核，將DNA切割成約50 kb的大片段，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，AIF從線粒體釋放與線粒體膜的通透性、鈣蛋白酶等有關(guān)，Luigi等在 Apaf1-/- HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-70（Heat Shock Protein-70,

3、 HSP70）能夠阻止AIF入核，從而阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡樣細(xì)胞死亡。然而，AIF在CML細(xì)胞凋亡被抑制中的作用機(jī)制尚不清楚。
　　為了進(jìn)一步了解AIF在CML發(fā)病中的作用，我們的研究思路是：構(gòu)建野生型凋亡誘導(dǎo)因子（Ad-Apoptosis-inducing factor，Ad-AIF）、缺線粒體定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域的凋亡誘導(dǎo)因子突變體（Ad-Apoptosis-inducing factor defected mitochondria l

4、ocalization sign, Ad-DMLS-AIF）和缺HSP70結(jié)合位點(diǎn)的凋亡誘導(dǎo)因子突變體（ Ad-Apoptosis-inducing factor-defected HSP70 banding domain, Ad-DHBD-AIF）的重組腺病毒載體，感染白血病 K562細(xì)胞后，觀察 Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF對(duì)慢粒白血病K562細(xì)胞凋亡的作用，探討AIF與CML細(xì)胞凋亡異常之間的關(guān)系。

5、
　　主要的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法：
　　1.構(gòu)建Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和 Ad-DHBD-AIF重組腺病毒載體。
　　將 K562細(xì)胞的cDNA作為模板，通過(guò)PCR得到的AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段分別克隆至穿梭載體pAd-Track-CMV-HA質(zhì)粒中，經(jīng)雙酶切、PCR和測(cè)序鑒定后，分別與骨架質(zhì)粒pAd-Easy1重組，得到的重組腺病毒質(zhì)粒分別經(jīng)PacⅠ線性化后，轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，進(jìn)行包裝

6、和擴(kuò)增，即得到Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和 Ad-DHBD-AIF重組腺病毒，同時(shí)將 pAd-Easy1質(zhì)粒進(jìn)行包裝和擴(kuò)增，得到空載腺病毒，作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。在空載腺病毒和三種重組腺病毒感染 K562細(xì)胞48 h時(shí)，通過(guò)western blot驗(yàn)證其在K562細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.觀察Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和 Ad-DHBD-AIF對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響。
　　在空載腺病毒和三種重組腺病毒感染K562

7、細(xì)胞0 h、24 h、48 h、72 h時(shí)，使用CCK-8檢測(cè)各組腺病毒對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的程度；在48 h時(shí)，通過(guò)Hoechst33258染色觀察K562細(xì)胞核形態(tài)的改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡情況；在24 h時(shí)，免疫熒光染色檢測(cè)重組腺病毒表達(dá)蛋白在 K562細(xì)胞中的定位，免疫共沉淀檢測(cè) AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否與HSP70相結(jié)合。
　　通過(guò)以上方法，我們得到以下結(jié)果：
　　1.通過(guò)雙酶切

8、、PCR和測(cè)序鑒定，構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒正確；PacⅠ酶切得到特異性的大小為4.5 kb的 DNA片段，說(shuō)明 Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和 Ad-DHBD-AIF構(gòu)建成功；Western blot檢測(cè)到三種重組腺病毒在K562細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2. CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與未處理組、空載腺病毒組、Ad-AIF組和Ad-DMLS-AIF組相比，隨著時(shí)間的增加， Ad-DHBD-AIF對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)抑制程度也增加。Hoech

9、st33258染色發(fā)現(xiàn) Ad-DHBD-AIF引起K562細(xì)胞染色質(zhì)凝集，而未處理組、空載腺病毒組、Ad-AIF組和Ad-DMLS-AIF組的K562細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ad-DHBD-AIF引起K562細(xì)胞凋亡的數(shù)目明顯高于未處理組、空載腺病毒組、Ad-AIF組和 Ad-DMLS-AIF組。免疫熒光染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， DHBD-AIF能進(jìn)入細(xì)胞核，AIF和Ad-DMLS-AIF均滯留于胞漿中；免疫共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn) AIF和

10、 DMLS-AIF均能與 HSP70相結(jié)合，而DHBD-AIF不結(jié)合HSP70。
　　綜上所述，三種重組腺病毒構(gòu)建成功，感染K562細(xì)胞后，與未處理組、空載腺病毒組、Ad-AIF組和 Ad-DMLS-AIF組相比， Ad-DHBD-AIF能夠引起K562細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，其表達(dá)的蛋白不與HSP70結(jié)合，并且能夠進(jìn)入細(xì)胞核，說(shuō)明在K562細(xì)胞中，AIF與HSP70結(jié)合可使 AIF滯留于胞漿中，不能發(fā)揮促凋亡的作用，從而表現(xiàn)出抵抗凋亡