超聲分子成像評價三突變型低氧誘導(dǎo)因子-1α的促血管生成效應(yīng).pdf

1、背景和目的：
　　 治療性血管新生(therapeutic angiogenesis)是通過人為地向局部組織輸送血管生長因子基因或重組蛋白的方式促進局部缺血組織血管新生,以達到改善缺血組織缺血缺氧和患者預(yù)后的目的[1-4]。它的出現(xiàn)為缺血性心血管疾病的治療提供了新的途徑[5-7]。在眾多的血管生長因子中,低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia induciblefactor-1,HIF-1)是細胞對缺氧作出適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子,

2、在缺氧條件下可穩(wěn)定表達,它通過對血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等上百種靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控而促進這些基因表達,參與血管新生、紅細胞生成等病理生理過程[8-11],可誘導(dǎo)生理功能完整的新生血管,促進側(cè)支血管的灌注,在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和外周血管閉塞性疾病等涉及治療性血管新生的疾病研究中,被認為是最具有臨床治療前景的基因[12,13]。
　　 HIF-1由兩個亞單

3、位構(gòu)成,氧調(diào)節(jié)亞單位HIF-1a和組成性表達的亞單位HIF-1β組成,HIF-1a受低氧誘導(dǎo),決定HIF-1的活性。然而,由于其獨特的結(jié)構(gòu),在常氧狀態(tài)下,HIF-1a的氧依賴性降解區(qū)(oxygen dependent degradationdomain,ODDD)402位脯氨酸(Prolyl,Pro)和564位脯氨酸(Prolyl,Pro)容易被脯氨酸羥化酶所羥化而介導(dǎo)HIF-1a與E3泛素連接酶復(fù)合體組分vonHippel-Linda

4、u腫瘤抑制蛋白(pVHL)相結(jié)合,進而啟動HIF-1a經(jīng)泛素.蛋白酶體途徑降解[14-16]；而轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(transactivation domain,TAD)803位天門冬氨酰(Asparageine,Asn)在HIF抑制因子(factor inhibiting HIF-1a,FIH)作用下發(fā)生羥基化,阻止HIF-1a與轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活因子CBP/p300結(jié)合,抑制其轉(zhuǎn)錄活性[17]。基于此,國外學(xué)者Tal等[18]對HIF-1a的Pr

5、o402、Pro564和Asn803進行定點突變,并分別將Pro402、Pro564、Asn803三位點突變型HIF-1a(HIF-1a402/564/803)、Pro564、Asn803雙位點突變型HIF-1a基因(HIF-la564/803)和野生型HIF-1a基因(nature HIF-1a)轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HIF-1a402/564/803的內(nèi)皮細胞其血管生成活性明顯高于轉(zhuǎn)染HIF-1a564/803和natu

6、re HIF-1a者。然而,在體內(nèi),三位點突變型HIF-1a基因?qū)θ毖M織血管新生的影響卻沒有得到充分的評價[19],首先,該研究利用CD31免疫組化染色來評價促三突變型HIF-1a在小鼠缺血下肢模型中的促血管新生能力,但CD31并不是新生血管的特有標記,CD31陽性血管并不能代表新生血管；其次,在成年期,血管新生(neovascularization)過程中包括血管發(fā)生(angiogenesis)和小動脈生成(arteriogenes

7、is),而該研究只評價其對血管發(fā)生的影響而未涉及到它對小動脈生成的影響。最后,該報道使用多普勒血流灌注成像僅能對血流量進行間接評價而不能直接顯示新生血管的分子靶點,不能對新生血管及早進行定量分析。
　　 超聲分子成像是近年來興起的一門無創(chuàng)性分子影像技術(shù)[20-23]并已經(jīng)實現(xiàn)了從分子水平對腫瘤性和缺血性血管新生的初步評價[24-32]。它通過對超聲造影劑微泡表面進行修飾,使其經(jīng)靜脈注入后靶向粘附、聚集并較長時間滯留于靶組織中,再

8、通過對比超聲(contrast-enhanced ultrasound,CEU)檢查而產(chǎn)生分子水平的特異的靶向超聲分子顯影,旨在發(fā)現(xiàn)疾病過程中特定分子水平或細胞水平的異常,從而實現(xiàn)疾病分子水平上的特異診斷[33-37]。和傳統(tǒng)的影像學(xué)技術(shù)依靠其物理學(xué)和組織生理學(xué)的改變來發(fā)現(xiàn)疾病、對疾病進行定性相比,具有先進性。
　　 超聲分子成像的關(guān)鍵是尋找“靶向目標”,并成功制備出與“靶向目標”具有高效、特異結(jié)合能力的靶向超聲微泡[38,39

9、]。因此,如果能夠構(gòu)建出與新生血管特異結(jié)合的靶向超聲微泡,將可以實現(xiàn)從分子水平對新生血管的無創(chuàng)性顯影。大量的研究表明,新生血管內(nèi)皮細胞表面表達大量的avβ3-整合素,有利于微泡造影劑的粘附聚集,是理想的成像靶點[37,40-45]。本實驗室在前期的研究中已成功構(gòu)建攜av-整合素單抗靶向微泡并實現(xiàn)基質(zhì)膠新生血管的靶向顯影[46]。
　　 超聲分子成像不但可以定性評價組織和器官的病理改變,還可以定量評價特定血管內(nèi)皮事件的嚴重程度。Y

10、eh等[47]成功在小鼠心臟炎癥模型中定量評價E-選擇素的表達,結(jié)果表明E-選擇素的表達量和E-選擇素分子信號強度成正相關(guān)。我們實驗室在腎臟微血管炎癥模型中同樣證實了微血管炎癥程度與內(nèi)皮P-選擇素超聲分子信號強度是正相關(guān)的[48]。
　　 因此,在本研究中,我們將應(yīng)用超聲分子成像技術(shù)定量評價三突變型HIF-1a在小鼠缺血下肢中的促血管生成效應(yīng)。
　　 方法
　　 1、動物模型的制備:對84只昆明小鼠(雌性,25～

11、30 g)結(jié)扎一側(cè)下肢股動脈制備下肢缺血模型,模型制備后將小鼠隨機等分為4組,分別經(jīng)肌肉注射40μl共4×108OPU腺病毒介導(dǎo)的β-半乳糖苷酶基因(Ad-LacZ,Ad-Lz)、腺病毒介導(dǎo)的野生型HIF-1a基因(Ad-nature HIF-1a,Ad-NH)、腺病毒介導(dǎo)的Pro564、Asn803雙位點突變型HIF-1a基因(Ad-double mutant HIF-1a,Ad-DM)和腺病毒介導(dǎo)的Pro402、Pro564、Asn

12、803三位點突變型HIF-1a基因(Ad-triplemutant HIF-1a,Ad-TM)。
　　 2、Real-time RT-PCR和免疫蛋白印跡(Western blot):基因轉(zhuǎn)染后第3天處死每組中3只小鼠,取注射局部肌肉組織行Real-time RT-PCR檢測HIF-1a及其下游基因血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素-1(angiopoi

13、etin-1,Ang-1)的表達情況；行Western blot檢測人HIF-1僅蛋白及下游VEGF蛋白的表達情況。
　　 3、對比超聲灌注成像:在術(shù)前即刻、術(shù)后0、7、14、21和28天分別對小鼠雙側(cè)下肢骨骼肌行對比超聲灌注成像評價缺血下肢骨骼肌的血流情況(n=6per group)。
　　 4、免疫熒光染色評價HIF-1a介導(dǎo)的血管新生(neovascularization)情況:術(shù)后第14、28天分別處死每組中3只

14、小鼠,取注射局部肌肉組織行Bandeirasimplificifolia-1(BS-1)凝集素免疫熒光染色和a-平滑肌肌動蛋白免疫熒光染色分別標記微血管和小動脈,評價血管發(fā)生(angiogenesis)和小動脈生成(arteriogenesis)。
　　 5、超聲微泡的制備及體外鑒定:生物素橋連法構(gòu)建攜av-整合素單抗靶向微泡(MBav)和攜同型抗體的對照微泡(MBiso)。采用庫爾特計數(shù)儀測量微泡的平均粒徑及濃度；采用綠色熒光

15、標記二抗與av-整合素單抗或同型抗體結(jié)合評價av-整合素單抗或同型抗體與超聲微泡的連接情況。
　　 6、靶向超聲分子成像:治療后第7天每組中6只小鼠分別經(jīng)尾靜脈隨機注射MBav和MBiso(間隔30min)并于8分鐘后行對比超聲檢查以評價血管新生情況。
　　 7、對比超聲圖像分析:(1)對于對比超聲灌注成像,采用MCE軟件分析缺血下肢和對側(cè)非缺血下肢骨骼肌的血容量、血流速度、血流量并制作彩色編碼圖；(2)對于靶向超聲分子

16、成像:測量實驗小鼠顯影的聲強度(Video intensity,Ⅵ)數(shù)值并制作彩色編碼圖。
　　 8、HE染色和av-整合素免疫熒光染色:超聲分子成像結(jié)束后,立即處死小鼠取缺血和非缺血下肢骨骼肌分別行HE染色和av-整合素免疫熒光染色。
　　 結(jié)論
　　 1、腺病毒介導(dǎo)的HIF-1a基因可通過血管發(fā)生和小動脈生成的方式促進缺血下肢血管新生,并且三突變型HIF-1a的促血管新生作用最強。
　　 2、采用“抗