高效靶向調(diào)控突變型Bik基因促淋巴瘤細(xì)胞凋亡研究.pdf

1、目的:Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡中最重要的家族,包括凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1等及具有凋亡誘導(dǎo)活性的蛋白Bax、Bad、Bik等,Bcl-2家族蛋白表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān),并且可能與腫瘤細(xì)胞對部分化療藥物的敏感性有關(guān)。淋巴瘤細(xì)胞中普遍存在Bcl-2、Bcl-xL等凋亡抑制蛋白的表達(dá)水平上調(diào)及Bik等促測亡蛋白的表達(dá)下調(diào),一方面使腫瘤細(xì)胞對凋亡的敏感性下降,另一方面也可能導(dǎo)致淋巴瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗

2、。Bik(Bcl-2 interactingkiller)作為Bcl-2家族中的一種僅含BH3結(jié)構(gòu)域的凋亡誘導(dǎo)蛋白,相對其他凋亡誘導(dǎo)蛋白而言,能結(jié)合的Bcl-2家族凋亡抑制蛋白最多,且與凋亡抑制蛋白中研究最多的Bcl-2及Mcl-1的結(jié)合力最強(qiáng),是常用的治療基因之一。而將野生型Bik的第33位蘇氨酸殘基和35位絲氨酸殘基替換為門冬氨酸可以模擬這兩個(gè)殘基的磷酸化使其成為突變型Bik(BikDD),這種模擬磷酸化可以提高Bik與凋亡抑制蛋白

3、的結(jié)合能力及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力。
　　 通過轉(zhuǎn)染BikDD(突變型Bik編碼基因)提高淋巴瘤細(xì)胞中的Bik表達(dá)水平可能是淋巴瘤基因治療的一種有效方法,但外源基因不能在靶部位獲得高效表達(dá)是目前腫瘤基因治療面臨的突出問題,本研究著重探討如何實(shí)現(xiàn)BikDD在淋巴瘤細(xì)胞中的高效特異性表達(dá)及研究BikDD表達(dá)對淋巴瘤細(xì)胞的促凋亡作用。
　　 方法:在研究的第一部分,構(gòu)建出含生存蛋白(Survivin)啟動(dòng)子、

4、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(hTERT)啟動(dòng)子及巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的熒光素酶表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)淋巴瘤細(xì)胞株Raji、Ramos、Hut78、U937和肝細(xì)胞株chang liver,通過檢測熒光素酶表達(dá)水平比較不同啟動(dòng)子在淋巴瘤細(xì)胞株中的表達(dá)效率與特異性,選擇在淋巴瘤細(xì)胞中具有較高效率及特異性的腫瘤特異性啟動(dòng)子。
　　 第二部分,利用Survivin啟動(dòng)子與WPRE、TSTA和VISA信號(hào)放大系統(tǒng)構(gòu)建出淋巴瘤特異性表達(dá)載體

5、S-WPRE、S-TSTA和S-VISA,通過檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的熒光素酶表達(dá)水平比較不同信號(hào)放大系統(tǒng)在淋巴瘤細(xì)胞株中的表達(dá)效率,選擇在淋巴瘤細(xì)胞中具有較高效率的放大系統(tǒng)與Survivin組成淋巴瘤特異性高效表達(dá)載體。
　　 在第三部分研究中,我們采用淋巴瘤特異性高效表達(dá)載體與BikDD治療基因轉(zhuǎn)染淋巴瘤細(xì)胞和肝細(xì)胞,并測定轉(zhuǎn)染后Bik表達(dá)水平,觀察其對淋巴瘤Bik表達(dá)的影響及其對淋巴瘤細(xì)胞的生長抑制與促凋亡作用。
　　 結(jié)

6、果:(1)Survivin啟動(dòng)子和hTERT啟動(dòng)子在淋巴瘤細(xì)胞都具有明顯高于陰性對照的活性(p＜0.01)。除在hut78細(xì)胞中Survivin啟動(dòng)子的活性低于hTERT啟動(dòng)子之外(p＜0.05),Survivin啟動(dòng)子和hTERT啟動(dòng)子在淋巴瘤細(xì)胞Raji、Ramos、U937細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性無明顯差異(p＞0.05),但Survivin啟動(dòng)子的淋巴瘤特異性明顯優(yōu)于hTERT啟動(dòng)子(p＜0.05),故選擇其作為進(jìn)一步構(gòu)建高效特異性淋巴瘤

7、表達(dá)載體的啟動(dòng)子。(2)S-VISA和S-TSTA在Raji、Ramos、Hut78及U937細(xì)胞中的熒光素酶表達(dá)水平明顯優(yōu)于pGL3-CMV(p＜0.05),在肝細(xì)胞中的熒光素酶表達(dá)水平明顯低于pGL3-CMV(p＜0.05),S-VSIA在Raji、Ramos、L1937中的熒光素酶表達(dá)水平高于S-TSTA(p＜0.05),分別為655.39％VS315.35％、413.01％VS272.33％、653.92％VS245.00％。而

8、在hut78細(xì)胞和chang liver細(xì)胞中表達(dá)水平無明顯差異(p＞0.05)。故選擇S-VISA作為進(jìn)一步淋巴瘤促凋亡研究的高效表達(dá)載體。(3)我們對于淋巴瘤細(xì)胞Bik水平檢測提示四種淋巴瘤細(xì)胞的Bik表達(dá)水平不同程度地低于肝細(xì)胞的Bik水平。S-VISA-BikDD轉(zhuǎn)染后能不同程度提高淋巴瘤細(xì)胞的Bik表達(dá)水平,并且對于淋巴瘤細(xì)胞Raji、Ramos、U937和Hut78具有明顯的生長抑制作用,對淋巴瘤Raji細(xì)胞具有促凋亡作用。