突變型FoxO1基因的體外和體內表達研究.pdf

1、代謝障礙綜合征包括肥胖癥、糖尿病、高血壓和心腦疾病等，嚴重危害著人類的健康。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1(forkhead box O1)參與的瘦素抵抗在代謝障礙綜合征的發(fā)生機制中具有重要的地位，F(xiàn)oxO1與其靶基因的相互作用就成為能量代謝領域的研究焦點之一。FoxO1可以作用于神經(jīng)肽基因前黑素細胞皮質素原(Pro-opiomelanocortin，POMC)的啟動子上，抑制POMC基因的轉錄，從而阻斷瘦素的信號通路，影響動物的能量代謝。為了研

2、究DNA結合結構域(DNA Binding Domain，DBD)在FoxO1功能中所起的作用，實驗室構建了敲除DBD的突變體，構建成質粒pCMV5-Myc-FoxO1Δ4-5(pFΔ4-5)。在此基礎上，本論文開展了此突變體的體內體外表達及其功能驗證試驗。首先，我們將pFΔ4-5進行擴增、酶切分析和序列測定;然后將相關質粒轉染至293Rb細胞（含瘦素受體的293細胞），western blot的檢測結果顯示細胞中有蛋白表達，表明該表達

3、載體構建成功;進一步的熒光素酶活性檢測結果表明，F(xiàn)oxO1能夠明顯地抑制POMC啟動子的活性，而缺失了DBD的FΔ4-5不但喪失了抑制作用，反而明顯地增強了POMC啟動子的活性，表明DBD是FoxO1發(fā)揮抑制所必需的;最后，將突變體基因進行顯微注射獲得了轉基因小鼠。將所得的6個F0代陽性轉基因小鼠與野生型小鼠進行交配繁育，基因型鑒定結果表明6個F0轉基因小鼠的子代中均存在陽性，表明FΔ4-5已整合至轉基因小鼠基因組中。然后，選取陽性轉基

4、因小鼠，對其各組織中轉基因的表達情況進行檢測，western blot的結果顯示目的蛋白在轉基因小鼠的下丘腦、肝、白色脂肪、棕色脂肪、脾、心、肺、腎等組織中均未表達，說明FΔ4-5雖然整合至轉基因小鼠的基因組中，但卻發(fā)生了基因沉默現(xiàn)象。為了明確目的基因是否是因為發(fā)生了啟動子甲基化而導致了基因表達抑制，我們進一步應用亞硫酸氫鹽測序法檢測了轉基因小鼠肝臟基因組DNA中CMV啟動子的甲基化情況，結果顯示CMV啟動子上的7個CpG位點均發(fā)生了較

5、高程度的甲基化，證實了我們的推測。隨后將不同劑量的地西他濱（5-aza-2deoxycytidine，5-aza）對小鼠進行腹腔注射，進行CMV啟動子的去甲基化研究。CMV啟動子甲基化分析和目的蛋白的western blot結果顯示，在注射5-aza后，雖然有去甲基化現(xiàn)象的發(fā)生，但目的蛋白仍未表達。結論:1.體外實驗結果證明DBD是FoxO1分子中抑制POMC啟動子活性的關鍵結構域;2.CMV啟動子控制突變型FoxO1基因在293Rb細