在肝癌細胞中突變型P53與GABPA相互作用上調(diào)突變型端粒逆轉(zhuǎn)錄酶TERT表達.pdf

1、肝細胞肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分別排第六位和第二位。由于起病隱匿，早期沒有癥狀或癥狀不明顯，進展迅速，確診時大多數(shù)病人已經(jīng)達到晚期，發(fā)生了局部侵襲或遠處轉(zhuǎn)移，治療困難，生存期短，預后差。近些年來關(guān)于肝細胞肝癌發(fā)病機制的研究越來越多，如細胞周期調(diào)控，表觀遺傳調(diào)控，端粒維持，基因突變等都在肝細胞肝癌發(fā)生和進展中發(fā)揮作用。已有研究發(fā)現(xiàn)肝細胞肝癌中存在P53蛋白的突變和TERT啟動子突變。P5

2、3蛋白是在人類腫瘤的發(fā)生過程中起著重要作用的抑癌蛋白，P53蛋白的突變或失活與多種人類腫瘤的發(fā)生相關(guān)。P53蛋白最常見的突變是單一位點的錯義突變，這種突變使正常的P53不能表達，失去了其原有的抑癌功能，表達突變型P53蛋白并獲得促癌功能，因此這種突變又被稱為功能獲得性突變。在肝細胞肝癌中P53蛋白的功能獲得性突變率高達32％。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶TERT是端粒酶的催化活性的亞單位，其在多種腫瘤中都處于異常激活的狀態(tài)，使細胞獲得無限增殖的能力，

3、因此被認為是腫瘤的重要標志物之一。TERT啟動子區(qū)特異性突變則是腫瘤細胞中TERT異常激活的重要機制之一。研究發(fā)現(xiàn)肝細胞肝癌中端粒逆轉(zhuǎn)錄酶TERT啟動子的突變率高達55％。GABPA是GA結(jié)合蛋白亞單位a，其作為一個轉(zhuǎn)錄激活因子，發(fā)揮著DNA結(jié)合的功能，并且它還參與了細胞色素氧化酶的活化和線粒體功能的細胞核調(diào)控機制。已證實在膀胱癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細胞瘤中GABPA可以選擇性結(jié)合于突變的TERT啟動子產(chǎn)生的ETS結(jié)構(gòu)域，從而激活TERT

4、表達，促進腫瘤進展。在肝細胞肝癌中TERT啟動子突變率高，但其具體的調(diào)控機制尚不清楚。GABPA是否也能以相同的方式激活并調(diào)控肝細胞肝癌中突變型TERT的表達，促進肝癌的發(fā)生發(fā)展，有待研究。肝細胞肝癌中P53蛋白的突變也很常見，那么突變的P53和GABPA，TERT之間是否存在相互調(diào)控關(guān)系，值得深入探討。
　　研究目的:
　　研究人肝細胞肝癌細胞系中經(jīng)典的抑癌蛋白P53的功能獲得性突變是否可以通過GABPA介導或與GABPA

5、共同調(diào)控端粒逆轉(zhuǎn)錄酶TERT的轉(zhuǎn)錄及其作用機制，為發(fā)現(xiàn)肝細胞肝癌中TERT調(diào)控的新機制，進而尋找新的分子靶標提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　(1)檢測肝癌細胞系TERT啟動子的突變情況:分別提取四種肝癌細胞系HepG2、Huh-7、Hep3B2.1.7、PLC/PRF/5的全基因組DNA，設(shè)計TERT啟動子引物，進行PCR擴增，產(chǎn)物送公司進行測序，篩選出TERT啟動子突變(C228T)的細胞系。
　　(2)檢測肝癌

6、細胞系HepG2、Huh-7中P53蛋白的表達水平:分別提取HepG2、Huh-7細胞總蛋白，Western Blotting檢測P53蛋白的表達水平，其中HepG2細胞為野生型P53蛋白，Huh-7細胞為Y220C突變型P53蛋白。
　　(3)檢測特異性siRNA下調(diào)或野生型/突變型高表達質(zhì)粒上調(diào)P53表達對TERT表達的影響:分別在HepG2、Huh-7細胞中轉(zhuǎn)染陰性對照或P53siRNA，72h后提取細胞總蛋白，Wester

7、n Blotting檢測P53蛋白水平，同時提取細胞RNA，qRT-PCR檢測TERT mRNA水平。在HepG2細胞中分別轉(zhuǎn)染野生型P53高表達質(zhì)粒和R175H突變的P53高表達質(zhì)粒，48h后提取細胞總蛋白，Western Blotting檢測P53蛋白水平，并提取RNA，qRT-PCR檢測TERT mRNA水平。
　　(4)研究特異性siRNA下調(diào)GABPA表達對TERT表達的影響:分別在HepG2、Huh-7細胞中轉(zhuǎn)染陰性對

8、照或GABPA siRNA，72h后提取細胞總蛋白，Western Blotting檢測GABPA蛋白水平，同時提取細胞RNA，qRT-PCR檢測TERTmRNA水平。
　　(5)免疫共沉淀試驗檢測P53蛋白與GABPA蛋白相互作用:提取HepG2、Huh-7細胞蛋白進行免疫共沉淀試驗，檢測P53蛋白與GABPA蛋白的結(jié)合情況。
　　(6)熒光素酶活性試驗檢測P53對TERT啟動子的調(diào)節(jié)作用:構(gòu)建TERT啟動子區(qū)域C228T

9、位點突變型啟動子報告質(zhì)粒，在Huh-7細胞中分別轉(zhuǎn)染P53siRNA和GABPA siRNA，以及共轉(zhuǎn)染P53siRNA和GABPA siRNA，24h后再轉(zhuǎn)染TK和突變型報告質(zhì)粒，48h后收集細胞檢測螢火蟲熒光和海腎熒光。
　　研究結(jié)果:
　　(1)四種肝癌細胞系HepG2、Huh-7、Hep3B2.1.7、PLC/PRF/5的TERT啟動子測序檢測，結(jié)果顯示HepG2、Huh-7中TERT啟動子為C228T位點突變型啟動

10、子，而Hep3B2.1.7、PLC/PRF/5中TERT啟動子為野生型啟動子。
　　(2)肝癌細胞系HepG2中P53蛋白為野生型，而肝癌細胞系Huh-7中為Y220C位點突變型P53蛋白。HepG2中野生型P53和Huh-7中Y220C位點突變型P53蛋白在細胞內(nèi)均有明顯表達，并且突變型P53蛋白表達水平明顯高于野生型P53蛋白。
　　(3)在肝癌細胞系HepG2中抑制P53蛋白表達后TERT mRNA水平升高，高表達野生

11、型P53后TERT mRN水平降低，而高表達突變型P53后TERT mRNA水平卻升高。在Huh-7中抑制突變型P53蛋白表達后TERTmRNA水平降低。
　　(4)肝癌細胞系HepG2、Huh-7中抑制GABPA蛋白表達后TERT mRNA水平均降低。
　　(5)在肝癌細胞系HepG2中野生型P53蛋白與GABPA蛋白未見明顯結(jié)合，而在Huh-7細胞中突變型P53蛋白與GABPA蛋白存在明顯結(jié)合。
　　(6)在肝癌細

12、胞系Huh-7中抑制突變型P53表達或抑制GABPA表達后，TERT啟動子活性均有不同程度的降低，而同時抑制突變型P53和GABPA表達后，TERT啟動子活性降低程度更為顯著。
　　研究結(jié)論:
　　(1)在不同的肝癌細胞系P53的表型不同。HepG2中為野生型P53蛋白，Huh-7中為Y220C位點突變型P53蛋白，并且兩種表型在各自的細胞中均有明顯表達。
　　(2)在不同的肝癌細胞系P53的表型影響其對TERT的轉(zhuǎn)錄