無義突變型熒光素酶穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立.pdf

1、目的:
　　建立穩(wěn)定表達(dá)含無義突變位點熒光素酶的細(xì)胞株，用以篩選新的無義突變通讀劑。
　　方法:
　　酶切質(zhì)粒pGL4-WT和pGL4-MUT，得到野生型和無義突變熒光素酶編碼cDNA，分別插入到慢病毒載體pLVX-IRES-Neo多克隆位點。酶切及PCR鑒定后，將重組載體包裝成慢病毒顆粒，感染HEK293細(xì)胞，單克隆細(xì)胞抗性篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR方法驗證熒光素酶mRNA表達(dá)。最后用已知陽性無

2、義突變通讀劑G418處理細(xì)胞，Western blot方法檢測處理前后熒光素酶蛋白表達(dá)水平，同時分析熒光素酶活性。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)酶切獲得2.7 kb長野生型和無義突變熒光素酶編碼cDNA，與pLVX-IRES-Neo連接獲得重組慢病毒載體pLVX-WT、pLVX-MUT，EcoRⅠ單酶切、NheⅠ與BamHⅠ雙酶切結(jié)果證明序列正確插入，PCR也擴(kuò)增出目的片段;穩(wěn)定感染慢病毒的HEK293WT和HEK293MUT細(xì)胞經(jīng)逆