Tet-on調(diào)控mPcdh18-siRNA表達(dá)的LLC穩(wěn)定細(xì)胞株的建立及鑒定.pdf

1、細(xì)胞黏附是細(xì)胞之間信息交流和傳遞的一種形式。鈣黏附蛋白家族是一類具有鈣離子依賴性的黏附分子。原鈣黏附蛋白是鈣黏附蛋白家族中最大的亞族，原鈣黏附蛋白18(Protocadherin18，Pcdh18)是原鈣黏附蛋白亞家族的成員。在斑馬魚中已發(fā)現(xiàn)Pcdh18的兩個(gè)同源蛋白Pcdh18a和Pcdh18b，同源性達(dá)70％。雖然兩者的表達(dá)模式不盡相同，但都在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)處表達(dá)。哺乳動物與斑馬魚的的Pcdh18有一半以上的氨基

2、酸完全相同，說明哺乳動物中的Pcdh18表達(dá)與定位可能和在斑馬魚中具有極高的相似性。
　　為了研究原鈣粘附蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中的生物學(xué)功能，生物學(xué)家們利用基因敲除技術(shù)除去相關(guān)基因，對基因敲除小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行觀察。這也是探究Pcdh18基因功能的主要思路。將RNA干擾技術(shù)與轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)相結(jié)合，以Tet系統(tǒng)介導(dǎo)RNA干擾過程，從外部精確調(diào)控靶基因表達(dá)的干擾程度，規(guī)避胚胎死亡，又能獲得缺陷表型倒推Pcdh18的基因功能。
　　

3、本研究旨在篩選出高效抑制mPcdh18表達(dá)的siRNA序列，建立并鑒定誘導(dǎo)表達(dá)mPcdh18-siRNA的LLC穩(wěn)定細(xì)胞株，為日后RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立打下基礎(chǔ)。本研究分以下兩部分進(jìn)行。
　　1.Tet系統(tǒng)誘導(dǎo)mPCDH18-siRNA在293T細(xì)胞中的表達(dá)
　　針對mPcdh18基因序列設(shè)計(jì)并體外合成三對siRNA，包括一對無關(guān)序列。利用本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建的mPcdh18與pEGFP-N1的融合表達(dá)載體pEGFP-m

4、Pcdh18，分別與三對siRNA瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并設(shè)置空白對照，在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，并以RT-PCR手段進(jìn)行mRNA水平檢測，得到基因抑制效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的siRNA序列都具有較強(qiáng)的抑制效果。
　　將三對siRNA對應(yīng)的反向互補(bǔ)DNA序列與pSingle-tTS-shRNA載體通過“酶切-連接”方式構(gòu)建融合表達(dá)載體pSingle-tTS-shRNA。與pEGFP-mPcdh18瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并

5、以適當(dāng)濃度DOX誘導(dǎo)，觀測熒光強(qiáng)度并檢測mRNA表達(dá)水平，得到基因抑制效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的siRNA序列在Tet系統(tǒng)內(nèi)仍然具有較強(qiáng)的抑制效果。
　　2.穩(wěn)定誘導(dǎo)表達(dá)mPCDH18-siRNA的LLC細(xì)胞株的建立及鑒定
　　以RT-PCR和Western-Blotting手段篩選數(shù)種鼠源及人源細(xì)胞，證實(shí)LLC細(xì)胞內(nèi)有mPcdh18基因和蛋白高表達(dá)。將pSingle-tTS-shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LLC細(xì)胞，G418篩選

6、得到穩(wěn)定細(xì)胞株。以qRT-PCR和Western-Blotting手段，測定不同濃度DOX誘導(dǎo)下，穩(wěn)定細(xì)胞株mPcdh18的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LLC細(xì)胞內(nèi)mPcdh18的表達(dá)水平隨著DOX濃度的增加呈明顯的降低趨勢，在DOX濃度1000μg/ml左右達(dá)到最強(qiáng)抑制效率，趨近80％。觀察穩(wěn)定細(xì)胞株的增值活性和細(xì)胞形態(tài)變化，并測定其生長曲線和細(xì)胞遷移能力，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增值活性降低，細(xì)胞狀態(tài)變差，遷移能力也有減弱。
　　綜上所述，本研究已篩