Tet-on系統(tǒng)調(diào)控分離酶上調(diào)表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞生物學(xué)性狀影響的初步研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文Tet-on系統(tǒng)調(diào)控分離酶上調(diào)表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞生物學(xué)性狀影響的初步研究姓名：付連仲申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：劉昕20080501第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文R N A 干擾，減少R a d 2 1r I 瓜N A 的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制，凋亡增加【1 7 】。H u i ‰g 等研究發(fā)現(xiàn)，在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)下，酵母細(xì)胞中類(lèi)似c a S p a s e s 的s e p a r a S e 通過(guò)切

2、割類(lèi)似R a d 2 1 的M c d l 誘導(dǎo)凋亡【1 8 】。s 印a r a s e 在細(xì)胞遺傳物質(zhì)的傳遞、基因組不穩(wěn)定性、腫瘤敏感性及凋亡中的重要作用引起我們極大關(guān)注。但是目前國(guó)內(nèi)、外的研究集中在正常真核細(xì)胞s 印嬲e 功能方面，而關(guān)于s 印a r a S e 在腫瘤細(xì)胞中的作用還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。既然有研究發(fā)現(xiàn)分離酶低表達(dá)或不表達(dá)可以增加腫瘤易感性，我們就假設(shè)如果讓本來(lái)s 印a r a s e 低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，那么其生物學(xué)

3、性狀會(huì)不會(huì)發(fā)生改變呢? 我們選擇H e l a 細(xì)胞作為研究的細(xì)胞株，主要是其異常染色體均數(shù)多達(dá)8 5 條，和正常宮頸上皮細(xì)胞染色體4 6 條差別明顯，有利于觀察染色體改變。隨著研究的進(jìn)展，我們證實(shí)了上調(diào)表達(dá)的s 印a r a s e 可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性程度，那么這種現(xiàn)象是否和s 印a r a s e 上調(diào)表達(dá)腫瘤細(xì)胞的凋亡改變有關(guān)呢? 本研究就H e l a 細(xì)胞( 腫瘤細(xì)胞) 中s 印a r a s e 上調(diào)表達(dá)后對(duì)

4、生物學(xué)性狀影響做初步的研究。二、方法和結(jié)果1 ．T e t —o n 系統(tǒng)表達(dá)調(diào)控模型的建立：質(zhì)粒P S K ．E s p l 用E c o R I ，S a c I I 雙酶切，膠回收目的片段E s p l ，定向克隆插入p T R E ．d 2 E G F P ，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后挑出正確的重組子，采用Ⅺ1 0 I ，S p h I 雙酶切鑒定插入方向，測(cè)序鑒定其序列的正確性，成功構(gòu)建E S p l ．p Ⅱ也．d 2 E G F P

5、表達(dá)載體。利用F u C m N E6 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染P T c t ．o n 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染2 4 h 后加G 4 1 8 ( 2 0 0 n ∥m 1 ) ，篩選2 周后挑選單個(gè)細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。將E s p l - p T R E —d 2 E G F P 質(zhì)粒與P T K ．H y g 質(zhì)粒按摩爾比為2 0 ：1 轉(zhuǎn)染已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染P T e t —o n 質(zhì)粒的H e l a 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染2 4 h 后加G 4 1 8 ( 6 0 0

6、斗∥m 1 ) ，潮霉素( 2 0 0 斗∥m 1 ) ，篩選2 周后挑選單個(gè)細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。用F Q ．P C R 、W B 分別在m R N A 和蛋白水平上檢測(cè)目的基因E s p l 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)強(qiáng)力霉素( D O x ) 的最適誘導(dǎo)濃度為2 0 0 n ∥m 1 ，E s p l m R N A 從0 ．2 9 3 增加至5 ．1 6 2 ( E S p l ／Q 心D H ) ，蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染后明顯增加。2 ．E s

7、p l 上調(diào)表達(dá)對(duì)H e l a 細(xì)胞倍性的影響：收集最適濃度2 0 0 n ∥m lD O X 誘導(dǎo)下的H e l a 細(xì)胞，采用秋水仙素法制備染色體，然后人工光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)染色體，同時(shí)利用染色體工作分析站自動(dòng)分析計(jì)數(shù)染色體。采用熒光染色細(xì)胞儀分析H e l a 細(xì)胞D N A 含量、倍性及細(xì)胞周期變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：E s p l 上調(diào)表達(dá)后，H e l a 細(xì)胞染色體均數(shù)從8 3 條降到7 1 條；H e l a 細(xì)胞倍性D I (