轉線粒體細胞株的構建及鑒定.pdf

1、目的：
　　 1.建立轉線粒體細胞模型
　　 2.觀察糖尿病家系融合細胞線粒體外部形態(tài)及初步功能表現(xiàn)
　　 對象與方法：
　　 1.研究對象含T10003C突變位點的糖尿病家系病人1例,2名正常對照(男、女各1例)。
　　 2.細胞系及培養(yǎng)p0HeLa細胞由呂斌老師惠贈。p0HeLa細胞培養(yǎng)基為高糖DMEM,含10％胎牛血清,補加尿嘧啶50μg/ml和丙酮酸鈉100μg/ml。選擇培養(yǎng)基為高糖DM

2、EM,含10％透析的胎牛血清。細胞培養(yǎng)于37℃,含5％CO2的孵育箱中,每2～3天換液1次,每周傳代1～2次。
　　 3.通過選擇培養(yǎng)基(不含尿嘧啶和丙酮酸鹽)初步鑒定p0HeLa細胞。
　　 4.提取細胞全基因組DNA,普通PCR擴增及Real-time PCR(TaqMan法)進一步驗證p0HeLa細胞。
　　 5.通過透射電鏡觀察正常HeLa細胞、p0HeLa細胞,進而觀察兩者之間差異,從細胞形態(tài)學直觀鑒定

3、p0HeLa細胞。
　　 6.以聚乙二醇為促融劑,采用無線粒體DNA的p0HeLa細胞與血小板進行融合。分離快速生長的單克隆細胞。
　　 7.提取細胞全基因組DNA,PCR擴增mtDNA第10003位所在片段,通過PCR擴增鑒定融合后細胞。
　　 8.透射電鏡觀察融合后細胞線粒體形態(tài)。
　　 結果：
　　 1.對數(shù)生長期p0HeLa細胞,換用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng),觀察細胞生長、形態(tài)及死亡情況。培養(yǎng)一周后

4、p0HeLa細胞明顯腫脹,輪廓增強,多數(shù)懸浮死亡。培養(yǎng)2周左右,細胞雖有部分存活,但較前明顯減少,細胞之間拉絲明顯,核內容物高倍鏡下解體。培養(yǎng)3周左右細胞聚集成團,輪廓清晰。培養(yǎng)4周左右,細胞幾無殘活。但同時用含尿嘧啶或丙酮酸鈉培養(yǎng)基,細胞生長較好,四至五天須消化傳代。表現(xiàn)出對尿嘧啶和丙酮酸鹽的依賴性。
　　 2.PCR產(chǎn)物電泳結果顯示正常HeLa細胞及融合細胞出現(xiàn)940bp的目的條帶,但p0HeLa細胞無相應條帶。從而初步提示

5、p0HeLa細胞株為mtDNA缺失的細胞株,融合細胞有功能性的mtDNA。Real-time PCR結果顯示經(jīng)過40個循環(huán)未檢測到mtDNA,但正常HeLa細胞呈現(xiàn)正?？截悢?shù)(108)。進一步說明此細胞株已無mtDNA殘留。
　　 3.透射電鏡結果示p0HeLa細胞鏡下線粒體嵴破壞,僅殘留部分,部分甚至缺如。線粒體出現(xiàn)空泡改變,核形態(tài)基本正常。正常hela細胞線粒體較多,呈圓形或橢圓形,基質較致密,嵴清晰。融合后細胞線粒體部分呈