人前腦啡肽原基因修飾永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株的構(gòu)建及其鎮(zhèn)痛效應(yīng)研究.pdf

1、疼痛是一種常見的臨床癥狀，很多病理性疼痛本身就是一種嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的疾病。對(duì)于慢性疼痛的治療，傳統(tǒng)的藥物鎮(zhèn)痛有諸多不可避免的缺陷，尤其是長(zhǎng)期用藥所致的藥物耐受及依賴，將直接導(dǎo)致治療的失敗，因此尋找一種安全有效、作用持久的鎮(zhèn)痛方法已成為疼痛研究的重要方向。近年來(lái)的研究表明，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植鎮(zhèn)痛是慢性疼痛治療新的研究領(lǐng)域，有望為疼痛治療提供一種全新的技術(shù)和方法。神經(jīng)前體細(xì)胞(neuralprogenitorcell，NPC)是一類可以分

2、裂增殖、自我更新并具有多分化潛能的細(xì)胞。它可以作為神經(jīng)細(xì)胞的種子細(xì)胞，在細(xì)胞移植治療和細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。但原代培養(yǎng)的NPC繁殖速度較慢，傳代周期長(zhǎng)，且為多克隆起源，難以滿足科研和臨床研究的需要。而永生化神經(jīng)前體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中能夠自我更新和無(wú)限擴(kuò)增，可以提供大量表型、基因型穩(wěn)定的神經(jīng)前體細(xì)胞，是轉(zhuǎn)基因治療的理想細(xì)胞載體。腦啡肽是一種內(nèi)源性的阿片肽，由前腦啡肽原經(jīng)酶切加工而來(lái)，廣泛分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是中樞

3、神經(jīng)系統(tǒng)重要的鎮(zhèn)痛介質(zhì)。本研究旨在構(gòu)建人前腦啡肽原基因(humanpreproenkephalingene，hPPE)修飾的永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株，并通過(guò)將其移植入神經(jīng)病理性痛大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，以評(píng)價(jià)其用于鎮(zhèn)痛治療的有效性和安全性。 研究方法與結(jié)果 1、猿腎病毒40大T抗原永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株的構(gòu)建 方法：采用貼壁法體外培養(yǎng)新生鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有猿腎病毒40大T抗原(

4、simianvirus40largetumorantigen，SV40Tag)基因的質(zhì)粒pCMVSV40T/PUR轉(zhuǎn)染神經(jīng)前體細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行連續(xù)傳代。觀察細(xì)胞的形態(tài)及其生長(zhǎng)狀況，應(yīng)用巢蛋白抗體進(jìn)行細(xì)胞鑒定，5％胎牛血清誘導(dǎo)細(xì)胞分化后，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)其分化能力。采用RT-PCR、Southern印跡雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)SV40Tag在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)果：體外成功培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞，細(xì)胞

5、巢蛋白表達(dá)陽(yáng)性，可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞；轉(zhuǎn)染SV40Tag后經(jīng)篩選培養(yǎng)后獲得1個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞克隆，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示細(xì)胞的巢蛋白和微管相關(guān)蛋白2染色為陽(yáng)性，增殖能力較強(qiáng)。5％胎牛血清可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞分化為微管相關(guān)蛋白2陽(yáng)性和膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。Southem印跡雜交結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組中存在SV40TagcDNA，并可檢測(cè)到SV40TagmRNA及其蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，命名為永生化神經(jīng)前體細(xì)胞(i

6、mmortalizedneuralprogenitorcell，INPC)。 2、永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞生物學(xué)特性研究 方法：選用連續(xù)傳代培養(yǎng)的INPC，觀察傳代、凍存和復(fù)蘇對(duì)細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)的影響，透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，應(yīng)用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、5’溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)摻入法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，采用裸鼠接種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的致瘤性，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞分化前后MHCⅠ和Ⅱ

7、類分子的表達(dá)評(píng)價(jià)其免疫原性。 結(jié)果：貼壁培養(yǎng)的INPC形態(tài)以橢圓形或三角形為主，有兩個(gè)或三個(gè)短的突起。細(xì)胞胞體較小，胞核較大，呈圓形，胞質(zhì)較少。細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，存在接觸抑制現(xiàn)象。凍存與復(fù)蘇不改變INPC細(xì)胞的形態(tài)及增殖能力，目前已傳至50余代。與原代NPC相比，INPC細(xì)胞增殖指數(shù)和增殖率升高，群體倍增時(shí)間縮短。裸鼠接種實(shí)驗(yàn)未見新生物長(zhǎng)出。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，有少量的INPC表達(dá)MHCⅠ和Ⅱ類分子，而5％胎牛血清誘導(dǎo)INPC分化后

8、，MHCⅠ和Ⅱ類分子的表達(dá)均為陰性。 3、人前腦啡肽原基因修飾永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株的構(gòu)建 方法：攜帶hPPE的重組腺相關(guān)病毒2型(recombinantadeno-associatedvirustype2，rAAV2)rAAV2/hPPE和含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，eGFP)的對(duì)照載體rAAV2/eGFP分別轉(zhuǎn)染INPC，轉(zhuǎn)染rAAV2/eGFP12h后開

9、始應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)rAAV2/eGFP的INPC綠色熒光蛋白的表達(dá)，并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，應(yīng)用巢蛋白抗體和猿腎病毒40抗體進(jìn)行細(xì)胞鑒定。5％胎牛血清誘導(dǎo)轉(zhuǎn)rAAV2/hPPEINPC分化后，應(yīng)用神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物抗體檢測(cè)其分化能力。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法、RT-PCR和放射免疫法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞亮氨酸腦啡肽(Leu-enkephalin，L-EK)的表達(dá)及分泌。 結(jié)果：INPC轉(zhuǎn)染rAAV2/eGFP12h后即有綠色熒光

10、蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染72h后，大部分細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90％。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示神經(jīng)前體細(xì)胞轉(zhuǎn)染rAAV2/hPPE后Nestin和SV40抗體染色均為陽(yáng)性，且可被血清誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)法、RT-PCR和放射免疫法結(jié)果均表明轉(zhuǎn)rAAV2/hPPE永生化神經(jīng)前體細(xì)胞hPPE的表達(dá)和L-EK的分泌明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P＜0.01)。 4、慢性神經(jīng)病理性痛大鼠鞘內(nèi)移植人前腦啡肽原基因修飾永生化大鼠

11、神經(jīng)前體細(xì)胞的鎮(zhèn)痛效應(yīng) 方法：成年雌性SD大鼠40只，隨機(jī)分為五組：Naive組，大鼠不進(jìn)行任何處理；Sham組，大鼠僅暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)分支；SNI組，大鼠右側(cè)下肢行保留性神經(jīng)損傷(sparednerveiniury，SNI)手術(shù)；INPC組和INPC/hPPE組大鼠分別于SNI術(shù)后1周鞘內(nèi)移植BrdU標(biāo)記的永生化神經(jīng)前體細(xì)胞INPC或轉(zhuǎn)rAAV2/hPPE永生化神經(jīng)前體細(xì)胞(INPC/hPPE)。持續(xù)觀察大鼠行為學(xué)改變，分別于

12、SNI術(shù)前、SNI術(shù)后1周至細(xì)胞移植后8周內(nèi)每周測(cè)定各組大鼠50％機(jī)械縮爪閾值(mechanicalwithdrawalthreshold，MWT)和熱縮爪潛伏期(thermalwithdrawallatency,TWL)。于細(xì)胞移植8周后取各組大鼠L4-6脊髓組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植細(xì)胞BrdU的表達(dá)和L-EK的表達(dá)，采用RT-PCR和放射免疫法檢測(cè)hPPE和L-EK的表達(dá)及分泌。 結(jié)果：SNI術(shù)后1周，大鼠痛覺行為學(xué)

13、發(fā)生改變，MWT和TWL降低(P＜0.05)；細(xì)胞移植后1周，INPC/hPPE組大鼠痛覺行為學(xué)癥狀明顯減輕，MWT和TWL升高(P＜0.05)，到細(xì)胞移植后第3周，已基本恢復(fù)至正常水平。細(xì)胞移植后8周，INPC組和INPC/hPPE組大鼠脊髓背角軟腦膜和脊髓淺層中均可檢測(cè)到移植細(xì)胞BrdU免疫染色陽(yáng)性，免疫細(xì)胞化學(xué)法、RT-PCR和放射免疫法結(jié)果均表明INPC/hPPE組hPPE的表達(dá)和L-EK的分泌高于其它四組(P＜0.05)。

14、 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示，組內(nèi)、組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)論 本研究成功地構(gòu)建了猿腎病毒40大T抗原永生化的大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株，該永生化細(xì)胞保留了原代NPC的細(xì)胞表型，為良性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)可作為載體細(xì)胞安全地用于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植研究；本研究進(jìn)一步構(gòu)建了